II TÉCNICAS DE SUPERRESOLUCIÓN

2.1. STED o Stimulated Emission Depletion Microscopy.

Stefan Hell desarrolló esta técnica utilizando dos rayos láser para iluminar la muestra: uno en configuración confocal que ilumina una región limitada por difracción, y otro que desactiva las moléculas en la orilla de esta zona por emisión estimulada. El segundo láser logra lo anterior gracias a que tiene un modo transversal en forma de “donut”, el cual rodea la iluminación del primer láser.

Con esto se logra que el área que produce la fluorescencia realmente sea de solo unos cuantos nanómetros. Midiendo la intensidad de la fluorescencia emitida por las moléculas que se encuentran solo en la región central del primer haz, se forma una imagen con una resolución hasta diez veces mayor a la obtenida con un microscopio confocal convencional.

2.2. PALM/ STORM

Por otro lado y llegando a los mismos resultados de resolución a nivel nanométrico se desarrollaron las investigaciones de William Moerner y Eric Betzig. Las cuales se basan en la localización de moléculas individuales.

Cuando la distancia entre moléculas fluorescentes es mayor al límite de difracción, es posible obtener un perfil de intensidad del patrón de Airy formado en el microscopio, cuyo análisis permite encontrar el centro del disco (esto es, la posición real de la molécula), con una exactitud que depende sobre todo del número de fotones que se detectan. (Ver Newsletter anterior).

Sin embargo, en una muestra real, la densidad de las moléculas fluorescentes debe ser alta para poder observar las estructuras, y la distancia promedio entre emisores es mucho menor al límite de difracción. Pues bien, para poder observar a los emisores individualmente, es necesario que solo una molécula por cada región espacial del orden de un disco de Airy este emitiendo luz y las demás estén apagadas o sin emitir luz. Esto se ha conseguido utilizando moléculas que pueden ser activadas con pulsos de luz de manera selectiva y estudiadas transitoriamente hasta que son destruidas o apagadas por otro haz de luz diferente. Esta activación se lleva a cabo mediante transformaciones foto-inducidas que llevan a los marcadores moleculares de una forma no-fluorescente a una forma fluorescente cuya emisión es detectada.

Una vez marcada la posición de cada emisor (por tanto de cada molécula), se reconstruye una imagen en forma de un mapa de localización que tiene una resolución diez veces mejor a la obtenida por técnicas convencionales. Esta metodología se ha seguido ido desarrollando en los últimos años y han dado lugar a la invención de una gran familia de técnicas que siguen los mismos principios, y son denominadas colectivamente como microscopía de super-resolución. El rápido avance que se ha dado en esta área ha ido a la par de una gran cantidad de estudios que han arrojado información sin precedentes sobre las estructuras de las células y su conformación, así como las propiedades, funciones e interacciones de proteínas in vivo.

En las técnicas de PALM se utiliza proteínas fluorescentes parecidas a la GFP fotoactivable que muestran un fotocromismo controlable, llamadas proteínas fluorescentes fotointerructores. Sin embargo, el desarrollo de STORM, que comparte el mismo principio fundamental, originalmente utilizó fluoróforos orgánicos reversibles fotoconmutables, como las cianinas que bajo ciertas condiciones de buffer, pueden transferirse entre un estado encendido o brillante y un estado apagado u oscuro. Para esto se utiliza luz roja y verde, además de fluoróforos activadores cercanos.

MEMRI

En esta nueva newsletter, el Servicio de Resonancia de Investigación quiere mostraros una técnica que lleva empleándose más de 20 años. Esta técnica se llama MEMRI: Manganese Enhanced MRI y está basada en el contraste T1 que puede generar el ión Mn+2 en imagen por Resonancia Magnética cuando es administrado como MnCl2.  

El Mn+2 es un elemento esencial para los organismos y participa como cofactor en varias familias de enzimas. Aunque es considerado como uno de los  menos tóxicos, la exposición excesiva a éste produce una toxicidad a nivel del sistema nervioso central. De hecho, encontramos mucha bibliografía en la que se describen muchos protocolos con distintas vias de administración. 

Puede entrar en el SNC a través de las neuronas receptoras de la via olfativa  y también a la barrera hematoencefálica por mecanismos de difusión o trasporte activo. Una vez que el Mn+2 está dentro del sistema nervioso, el Mn+2 es transportado por los microtúbulos que existen en el transporte axonal, participar en la sinapsis y acumularse en las neuronas vecinas.

El uso del Mn+2 como agente de contraste en RM fue empleado por primera vez hace 20 años en ratas anestesiadas y fue utilizado para estudiar su toxicidad. El primero que empléo MEMRI para estudiar la actividad cerebral y los tractos neuronales fue Koretsky.  

MEMRI tiene tres principales aplicaciones en los sistemas biológicos:

  • Proporciona un aumento del contraste anatómico
  • Evalúa la actividad dependiente de la concentración de Mn+2
  • Hace posible trazar las conexiones neuronales o seguimiento de los tractos

MEMRI se basa entonces en las tres propiedades del Mn+2 :

Es un ion paramagnético que acorta el tiempo de relajación T1 del agua;  en aquellas zonas donde se acumule producirá un aumento de contraste T1, imágenes hiperintensas con acortamiento de los valores del T1. Como es un análogo al Ca+2, éste puede entrar en las células excitables (neuronas o células cardiacas con canales de Calcio dependientes de voltaje)

La combinación de las propiedades físicas y biológicas del Mn+2 hace que sea un contraste eficaz para imagen anatómica y funcional en múltiples sistemas. Actualmente, las aplicaciones principales son:                               

  • Variación del contraste T1: la inyección sistémica del Mn+2 se utiliza para estudiar la citoarquitectura cerebral en estudios anatómicos. Esta técnica que ha sido usada en adultos también se utiliza en organismos en desarrollo, por ejemplo para estudiar el desarrollo de los embriones en el útero.

Imagen MEMRI-T1 de útero con y sin Mn+2 (A) y proyección en 3D (MIP) para estudiar la vasculatura
  • Como el Mn+2 puede entrar en las células a través de los canales de Ca+2 dependientes de voltaje, se usa también como marcador de la actividad en determinados protocolos que estudian la acumulación en áreas cerebrales activas. También tiene aplicación en estudios cardíacos por la alta concentración de canales de Ca+2.
  • MEMRI se usa también como un trazador de los tractos neuronales para varias vías neuronales. Incluyendo la visual, olfativa y la somatosensorial en varios modelos animales como la rata, ratón, monos y pájaros.
  • Incluso se ha demostrado que con MEMRI se pueden detectar lesiones y que el transporte de Mn+2 dentro de las neuronas de la médula espinal puede incluso dar una indicación del grado de recuperación de la médula en roedores.

Un artículo publicado en 2020 estudia como con la técnica MEMRI se puede caracterizar las vías ascendentes y descendientes de la médula espinal. Existen varios artículos que describen la técnica y uno es de los que se resume a continuación.

Como ya sabéis todos, la médula espinal está compuesta por nueve láminas celulares distintas que hasta ahora solo se podían visualizar  por métodos histológicos.  Los métodos de imagen que se están desarrollando permiten visualizar la arquitectura laminar in vivo. La técnica MEMRI como ya se comentó anteriormente, puede dar una información funcional y estructural  en el cerebro y tiene una gran potencialidad para caracterizar las vías neuronales de la médula espinal.

El empleo de técnicas de imagen no invasiva para monitorizar la viabilidad de las neuronas motoras en la médula espinal podría contribuir a encontrar nuevas estrategias terapéuticas para enfermedades cuyo origen está en las neuronas motoras.  La mayoría de estas enfermedades afectan inicialmente a una población específica determinada dentro de la médula y no producen grandes cambios estructurales. Por tanto, se necesitan desarrollar nuevas tecnologías que permitan por métodos no invasivos estudiar la función de la médula espinal. Sin embargo, el poder obtener imágenes de alta resolución conlleva un reto porque hay que tener una serie de factores tales como el movimiento del animal, la profundidad del tejido y el artefacto de susceptibilidad del líquido cerebroespinal y de las vértebras que pueden estropear la calidad de la imagen.

En el artículo también se describe como con MEMRI se pueden visualizar las regiones laminares I-IX del segmento torácico por un aumento en la intensidad de la imagen por contraste T1.  Insistiendo siempre que todas estos resultados tienen que estar confirmados por técnicas histológicas.

Existen numerosos artículos publicados que explican las diferentes formas de administración del MnCl2. En el artículo comentado aquí, el MnCl2 se inyectó via ip y la imagen no se tomó hasta 48 horas después.

El protocolo de imagen descrito en el artículo fue aplicado en un equipo de de 11.7T, que permite trabajar con resoluciones mejores que para un 7T como el que disponemos en el laboratorio. Se adquirieron imágenes potenciadas en T1 y también  mapas paramétricos de T1 con varios tiempos de repetición en la secuencia para obtener los valores cuantitativos de T1 en determinadas regiones de interés, siempre en situación basal y post-administración de MnCl2.

Al haber adquirido varias imágenes de T1 con distintos tiempos de repetición (TR) es posible obtener los  mapas de T1. En las rois seleccionadas se puede obtener el valor de T1 antes y después de haber administrado MnCl2.

Como ya comentamos anteriormente, una vez realizada la imagen, los animales fueron sacrificados para poder comparar los resultados obtenidos de RM con cortes histológicos preparados para inmunohistoquímica e inmunofluorescencia.

El articulo demuestra en sus estudios como con la administración de Mn+2 se pueden diferenciar las distintas láminas de la médula espinal mediante imagen por Resonancia Magnética in vivo. Por supuesto, vosotros poséis un gran conocimiento de la estructura anatómica de la médula espinal y sois capaces de reconocer estas zonas mediante cortes histológicos pero es un reto emocionante y muy atractivo el poder estudiar estos tractos in vivo. Os animo a la lectura de los artículos que os adjunto y si tenéis curiosidad por la técnica no dudéis en contactar con el servicio de Resonancia Magnética

Bibliografía

  1. Benedikt T. Bedenk, Suellen Almeida-Corrêa, Angela Jurik, Nina Dedic, Barbara Grünecker, Andreas J. Genewsky, Sebastian F. Kaltwasser, Caitlin J. Riebe, Jan M. Deussing, Michael Czisch, Carsten T. Wotjak. Mn2+ dynamics in manganese-enhanced MRI (MEMRI): Cav1.2 channel-mediated uptake and preferential accumulation in projection terminals. NeuroImage,Volume 169,2018,Pages 374-382
  • Zhang J., Wu D., Turnbull D.H. (2018) In Utero MRI of Mouse Embryos. In: García Martín M., López Larrubia P. (eds) Preclinical MRI. Methods in Molecular Biology, vol 1718. Humana Press, New York, NY.
  • Cynthia A. Massaad and Robia G. Pautler Manganese-Enhanced Magnetic Resonance Imaging (MEMRI) . Methods Mol Biol. 2011 ; 711: 145–174. doi:10.1007/978-1-61737-992-5_7
  • Vijai Krishnan, Jiadi Xu, Albert German Mendoza, Alan Koretsky, Stasia A Anderson, Galit Pelled. High-resolution MEMRI characterizes laminar specific ascending and descending spinal cord pathways in rats. Journal of Neuroscience Methods. Volume 340. 2020, 108748, ISSN 0165-0270. https://doi.org/10.1016/j.jneumeth.2020.108748.

Análisis robusto, reproducible y cuantitativo de miles de proteomas por LC-MS/MS de flujo micro

La cromatografía líquida de nano-flujo ha sido el pilar en la investigación de proteomas durante más de 20 años, principalmente porque los flujos bajos mejoran la ionización de péptidos por electrospray (ESI) por espectrometría de masas (MS) y, por lo tanto, la sensibilidad. Sin embargo, esto tiene como inconveniente el desafío de fabricar columnas reproducibles y duraderas, mantener el electrospray estable durante períodos de tiempo prolongados, realizar cargas cromatográficas rápidas, tener saturación en la espectrometría y, a menudo, largos tiempos improductivos para la transferencia de muestras a velocidades de flujo bajos. Estos factores pueden limitar la reproducibilidad de la identificación y cuantificación de péptidos, así como la exhaustividad, solidez y rendimiento del análisis de proteomas, especialmente cuando se analizan muestras de alta complejidad o amplio rango dinámico de concentraciones de proteínas como ocurre en tejidos y fluidos corporales.

Particularmente para ensayos de espectrometría de masas cuantitativos como SRM (Selected reaction monitoring) o PRM (parallel reaction monitoring), donde el espectrómetro de masas se enfoca en una pequeña cantidad de analitos para maximizar la sensibilidad y la precisión cuantitativa, columnas de HPLC analíticas estándar (2,1 mm de diámetro interno, DI) se utilizan con frecuencia para abordar los desafíos antes mencionados. También para los análisis de adquisición independiente de datos (DIA), métodos que tienen como objetivo detectar los péptidos presentes en una muestra de forma sistemática, el campo está adoptando cada vez más columnas de diámetro interno de 300 µm como compromiso entre sensibilidad y robustez.

Como la sensibilidad de los espectrómetros de masas ha mejorado enormemente a lo largo de los años como resultado de, por ejemplo, una ionización más eficiente  o una mejor transferencia y detección de iones,  nuevos avances en estrategias no dirigidas o dependientes de datos (DDA) pueden llevarse a cabo mejorando la separación peptídica.

Figura 1. Características de rendimiento cualitativo del sistema LC – MS / MS de micro-flujo.  

El área de la sección transversal de una columna LC de flujo micro de 1 mm de DI es 178 veces más grande que el de una columna LC de nano flujo de 75 µm de DI que se utiliza normalmente en la investigación de proteomas y el incremento en el flujo se incrementa de la misma manera (Fig. 1a). Mientras que un diámetro de columna más amplio mejora la eficiencia de la separación al eliminar la sobrecarga de la columna, el mayor caudal necesario para una columna de 1 mm de DI en comparación con una columna LC de nano flujo, diluye masivamente el analito, concentración que debería conducir a una fuerte pérdida de la eficiencia de ionización en el electrospray (ESI) y, como resultado, pérdida en la sensibilidad. Pero se ha encontrado que esto se puede compensar parcialmente por los picos tan estrechos que proporciona la tasa de flujo más alta produciendo la concentración de péptido (Fig. 1b).

Por ello, el uso en auge del flujo micro, usando una columna de 1 × 150 mm muestra una excelente reproducibilidad del tiempo de retención cromatográfica (<0.3% coeficiente de variación, CV) y cuantificación de proteínas (<7.5% CV) usando datos de más de  2000 muestras de líneas celulares, tejidos y fluidos corporales humanos. El análisis profundo de proteomas identifica más de 9.000 proteínas y más de 120.000 péptidos en 16 h, y la multiplexación de muestras marcadas utilizando la espectrometría en tándem aumenta el rendimiento a 11 proteomas en 16 h. El sistema identifica más de 30.000 fosfopéptidos en 12 horas y los experimentos de interacción proteína-proteína o proteína-fármaco pueden analizarse en 20 minutos por muestra. La misma columna se puede utilizar para analizar más de 7500 muestras sin una aparente pérdida de rendimiento.

Estos datos demuestran que la LC – MS / MS de microflujo es adecuada para una amplia gama de aplicaciones proteómicas.

Artículo:

https://www.nature.com/articles/s41467-019-13973-x

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AUTOR

Alba González Arandilla, MSc.
Química
Técnico Titulado Superior del Servicio de Proteómica
Hospital Nacional de Parapléjicos
Toledo, España.

ATLAS MRI

En esta nueva entrada del SAI de Resonancia Magnética de Investigación os hablo de una de las cuestiones más complicadas que se plantean al hacer estudios de un gran número de animales.  ¿Podriamos estudiar las diferencias que existen cuando hacemos experimentos de volumetria entre diferentes grupos de animales? La respuesta es que: Dos cerebros de rata nunca serán iguales: el cerebro puede cambiar en la forma y en el volumen de un individuo a otro.

Para poder compararlos en tamaño, forma y volumen se necesita recopilar los datos de muchos estudios de RM multiparamétricos, y es lo que han hecho creando un Atlas de cerebro de rata. Los autores del trabajo confían en que los modelos estandarizados y los atlas normalizarían estas diferencias. En clínica, los atlas de imagen RM, se llevan utilizando muchos años, pero en animales apenas hay, de ahí la necesidad de recapitular y confeccionar uno más completo de los pocos existentes. Este atlas lo han desarrollado Barriére, Magalhaes y cols. Y se ha publicado en Nature´s Comnunication  (Nature Communications volume 10, Article number: 5699 (2019)).

Hasta el momento se habían descrito varios atlas para estudiar el cerebro de rata por Imagen de Resonancia Magnética pero cada uno de ellos tiene sus limitaciones.

El Waxholm Space Atlas está elaborado con cerebros de Rata Sprague Dawyley a muy alta resolución, pero sus ficheros son muy pesados aunque solo se ha hecho a partir de imágenes exvivo de una sola rata Sprague Dawley.

https://www.nitrc.org/projects/whs-sd-atlas

El atlas de la Universidad de Tohoku incluye datos in vivo de Ratas Wistar pero es de más baja resolución y cubre menos cerebro

http://doc.pmod.com/pneuro/wistarratbrainatlastohoku8102.html

Por eso, Barriére y cols., han combinado las imágenes de Resonancia Magnética tanto in vivo como exvivo de 47 ratas Wistar macho de 8 semanas para crear un modelo anatómico que distingue entre la sustancia gris, la blanca y el líquido cefalorraquídeo. Combinando los dos atlas, el de Waxholm y el de Tokohu, el equipo ha creado un atlas anatómico que cubre el volumen total de cerebro. También describe un atlas funcional a partir de datos de resting state Fmri de animales anestesiados.

El objetivo final de este atlas ha sido el crear un puente entre el campo de la neuroimagen básica y la clínica.

Si quieres saber más de este atlas, os adjunto el artículo

https://www.nature.com/articles/s41467-019-13575-7

GUÍA PARA PRINCIPIANTES

Las recientes publicaciones [1],[2] en las que se resumen fundamentos y estrategias de los conceptos básicos de proteómica basada en espectrometría de masas, nos han hecho recapitular y revisar un poco los recursos y lecturas de interés para aquellos que se inicien en este mundo de la proteómica.

Por ello hacemos una revisión de nuestras fuentes y os dejamos unos cuantos enlaces y reseñas para ir introduciéndose en la espectrometría de masas, los procesos de preparación de muestras y las estrategias de cuantificación y análisis.

Fundamentos de la espectrometría de masas

La espectrometría de masas (MS) es un método que puede analizar una variedad de compuestos químicos y biológicos. Los espectrómetros detectan la presencia y abundancia de biomoléculas (péptidos, proteínas, metabolitos y lípidos) o de productos de síntesis utilizando propiedades fundamentales de las moléculas, como la masa y la carga neta.

Todos los espectrómetros de masas tienen tres componentes fundamentales: una fuente de ionización, un analizador de masas y un detector.

Fig.  1 Componentes básicos de un espectrómetro de masas típico. * FT-ICR no utiliza un multiplicador de electrones. APCI, ionización química a presión atmosférica; ESI, ionización por electropulverización; MALDI, desorción / ionización láser asistida por matriz; FT-ICR, resonancia ion-ciclotrónica de Fouriertransform.

Una de las principales páginas para conocer los fundamentos de la espectrometría de masas es la página creada por la American Society for Mass Spectrometry (ASMS) en ella encontrareis grandes charlas.

Podéis encontrar links interesantes en YouTube donde se muestra cada una de las partes de los espectrómetros y los diferentes tipos de modos de ionización (ESI, MALDI, APCI, EI…), tipos de analizadores (tiempo de vuelo, cuadrupolo, trampa de iones, orbitrap) o una combinación de ellos (analizadores en tándem), y detectores. Las casas comerciales suelen publicar en sus canales videos mostrando sus últimos avances. Os recomendamos los canales del Broad Institute, IIT Bombay entre otros.

Uno de nuestros recursos educativos favoritos es la página de IonSource, en ella podéis encontrar diversos tutoriales sobre identificación, cuantificación y una gran recopilación de enlaces para definiciones, referencias, historia, Instituciones, etc.

Otro de los enlaces interesantes es al glosario de términos del Kings College de Londres, ya que la terminología utilizada está llena de siglas y acrónimos que debemos traducir para aquellos que se inician en este campo.

Para reseñas más antiguas, pero con descripciones muy completas tenéis la revisión de Glish, G., et al[3], Graves, PR., et al[4] y de la NIAAA donde se comienza desde la perspectiva genómica / transcriptómica y va avanzando.

Fig.  2 Resumen de la información básica generada durante los experimentos basados en MS. Las flechas muestran la información experimental recopilada de cada paso del MS. Esta información es crucial para permitir una identificación precisa de proteínas mediante análisis computacional.

Si queréis profundizar aún más, os engancha la interpretación de espectros y las reglas de fragmentación, necesitareis como biblia “Interpretation of mass spectra” de F.W. McLafferty o una revisión un poco más abreviada por Nicolescu T.O.

AUTOR

Gemma Barroso-García, MSc.
Responsable del Servicio de Proteómica.
Hospital Nacional de Parapléjicos.
Toledo, España.

REFERENCIAS

[1] Sinha A., Mann M. A beginner’s guide to mass spectrometry-based proteomics. Biochem (Lond). 2020; BIO20200057. Published 2020 Sep 09. https://doi.org/10.1042/BIO20200057

[2] Zainab Noor, Seong Beom Ahn, Mark S Baker, Shoba Ranganathan, Abidali Mohamedali, Mass spectrometry–based protein identification in proteomics—a review, Briefings in Bioinformatics, bbz163, https://doi.org/10.1093/bib/bbz163.

[3] Glish, G., Vachet, R. The basics of mass spectrometry in the twenty-first century. Nat Rev Drug Discov 2, 140–150 (2003). https://doi.org/10.1038/nrd1011

[4] Graves P.R., Haystead T.A.J. Molecular Biologist’s Guide to Proteomics. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2002;66:39–63. doi: 10.1128/MMBR.66.1.39-63.2002

CITOMETRÍA GENÓMICA, ANÁLISIS DE CÉLULA ÚNICA Y MULTIÓMICA

Las tecnologías de análisis de célula única están proporcionando un conocimiento sin precedentes sobre la complejidad de los sistemas biológicos. Las herramientas clásicas analizan poblaciones celulares en masa y, en consecuencia, una parte de los procesos biológicos permanece invisible. Un ejemplo es la existencia de ciertos tipos celulares que están muy poco representados (raros), pero que pueden tener importantes funciones fisiológicas o patológicas.

Con estas tecnologías, que se vienen desarrollando desde al año 2015, se está encontrando que las poblaciones celulares son más heterogéneas de lo que se había imaginado nunca. Cada célula única es diferente en términos de espacio (posición dentro de un tejido u órgano), tiempo (fase del ciclo celular, estado de activación, fase de desarrollo etc) y perfil molecular.

La citometría de flujo multiparamétrica compleja, que introdujimos en la anterior newsletter, nos permite llegar a un nivel de resolución de poblaciones celulares muy bueno, pudiendo identificar subpoblaciones celulares poco representadas o eventos raros. Además, está resultando una herramienta muy útil para diseccionar la complejidad fenotípica y funcional de las distintas poblaciones celulares de una muestra, tejido u órgano. Sin embargo, si queremos relacionarlas con los niveles de expresión génica o proteica tenemos que recurrir a otras tecnologías que nos permitan identificar el perfil de cada una de las células a nivel de RNA, DNA o de proteína.

Como sabemos, la citometría es toda aquella tecnología que permita medir características de las células. La citometría genómica es un conjunto de técnicas que nos van a permitir medir otras características como la expresión génica, pero a nivel de célula única, y además relacionarlas con otras características como la expresión de proteínas, de ahí que podamos considerar todas estas tecnologías como una aproximación multiómica.

Fig.1: Workflow de experimentos de citometría genómica

Todas las tecnologías de análisis de célula única dependen de la separación física de las células de forma individual en un volumen de reacción que permita la aplicación de tecnologías posteriores de secuenciación de DNA o RNA o de análisis proteómico. Esto va a permitir caracterizar el genoma, el transcriptoma o el proteoma de cada célula individual.

Existen tres métodos principales de separación y preparación de las muestras para la realización de técnicas de análisis de célula única:

  • Métodos de separación en placa multipocillo basados en citometría de flujo.
  • Métodos basados en microfluídica o separación en nanopocillo.
  • Métodos de indexado combinatorial basados en citometría de flujo.

Aunque también existen métodos basados en imagen y métodos de transcriptómica espacial, no son objetivo de este artículo (ver referencia Salomon R et al 2020).

A continuación, pasamos a explicar un poco más en detalle cada uno de ellos

Fig. 2: Métodos para la separación y preparación de muestras para tecnologías de análisis de célula única

Separación de células individuales en placas multipocillo por citometría de flujo

Es el método clásico utilizado para la obtención de células únicas. Se basa en la separación celular activada por fluorescencia (FACS= “Fluorescence-Activated Cell Sorting”) de las células de interés en base a unos parámetros de fluorescencia determinados. De esta forma, lo que se hace es definir una población celular determinada y se programa al citómetro separador para depositar una única célula en cada pocillo de una placa, ya sea de 96 pocillos o de 384, en los cuales previamente hemos añadido el volumen de tampón de reacción correspondiente según la técnica posterior de análisis que queramos realizar.

Por ejemplo, en el caso de querer obtener información sobre el transcriptoma de una célula se podrá utilizar un sistema como el Smart-seq2 que permite hacer una primera reacción de retro-transcripción con un material de partida de incluso 50 pg de RNA, y una posterior amplificación de cDNA para la obtención de una librería que se secuencie posteriormente.

Separación de células por microfluídica o en nanopocillos

Son sistemas que incrementan la capacidad de analizar un mayor nº de células y que eliminan ciertos errores o imprecisiones de pipeteos para realizar las reacciones posteriores a la separación celular.

Existen dos sistemas: uno que utiliza microchips en los cuales se van a ir combinando células individuales con esferas marcadas con un código de barras en forma de oligonucleótido en el interior de gotas de reacción, y un segundo método que también deposita células individuales junto con esferas marcadas con oligonucleótidos, pero lo hace en nanopocillos impresos en un microchip dónde se produce la reacción posterior de amplificación de RNAs y generación de librerías como en el caso anterior.

Su ventaja principal es que las esferas que se combinan con las células tienen todos los reactivos necesarios para la amplificación y generación de librerías, evitando así la necesidad de preparar la reacción a posteriori (implica menos errores o imprecisiones).

Indexado combinatorial basado en citometría de flujo

Este sistema se basa en una primera separación de las células de forma individual, cada una en un pocillo mediante FACS, y la adición de un primer código de barras a cada uno de los pocillos. A continuación, se hace un pool con todas las células o núcleos separados y se realiza una segunda separación en placa, añadiendo un nuevo código de barras a cada pocillo. De esta forma, cada una de las células posee un código único de identificación por la combinación de varios códigos de barras.

El tratamiento posterior de las muestras viene siendo el mismo que lo expuesto anteriormente.

MULTIÓMICA

Aunque la transcriptómica es una fuente de información muy importante, existen otras lecturas que pueden revelar otras diferencias entre unas células u otras. Así, se podrían hacer análisis multiómicos: RNA con DNA, RNA con proteína, DNA con proteína o incluso RNA con modificaciones epigenéticas (metilaciones etc). Las aproximaciones metabolómicas y proteómicas están comenzando a desarrollarse poco a poco, pero serán importantes en un futuro próximo.

Actualmente una de las aproximaciones multiómicas que se pueden realizar es relacionar los datos de transcriptómica obtenidos con la expresión de proteínas analizada por citometría de flujo.

Cuando realizamos la tinción de las células con anticuerpos o sondas que caracterizan distintas poblaciones celulares, vamos a obtener datos en masa de las poblaciones en su conjunto. Sin embargo, al realizar la separación por FACS podemos pedirle al citómetro que guarde los datos de fluorescencia y dispersión de la luz para cada una de las células que está depositando en cada pocillo. Este proceso se denomina Index Sorting.

Además del Index Sorting existen otros métodos para poder relacionar los datos obtenidos de la transcriptómica con la expresión de proteínas, como puede ser CITE-seq. CITE-seq utiliza anticuerpos marcados con oligonucleótidos específicos que convierten la detección de proteínas en una secuencia de DNA que puede ser cuantificada. Así, los oligos unidos a los anticuerpos actúan como transcritos sintéticos que van a ser retrotranscritos, amplificados y secuenciados simultáneamente con los transcritos de la célula en cuestión. De esta forma, cuando se obtienen los datos de los mRNAs expresados por cada una de las células, se obtienen también los datos de qué proteínas están expresando e incluso sus niveles de expresión.

La relación de unos parámetros con otros (expresión protéica – RNA) requerirá un análisis de los datos diferente al análisis de datos de citometría convencional, que incluye técnicas de reducción dimensional y clustering, similares a las que se pueden usar para el análisis multiparámetrico complejo, y que veremos en próximas newsletters.

Fig.3: Workflow del análisis de datos

Lecturas recomendadas:

– Salomon R et al (2020) Cytometry A: https://doi.org/10.1002/cyto.a.24209

– Luecken M.D. and Theis F.J. (2019) Mol Sys Biol: https://doi.org/10.15252/msb.20188746

– Cossariza A et al (2019) Eur. J. Immunol:  https://doi.org/10.1002/eji.201970107

INTRODUCCIÓN A LA SÚPER-RESOLUCIÓN

La microscopía óptica es una de las herramientas más importantes de las ciencias en general y en la biología en particular ya que permite observar en un tamaño aumentado elementos que son imperceptibles a simple vista. A través de los años se han desarrollado numerosas técnicas para mejorar tanto el contraste como la calidad de las imágenes obtenidas mediante microscopia. Sin embargo, estas técnicas se encontraban limitadas por la resolución con la que se podían observar las muestras. Ésta Newsletter es la primera de una serie de tres, en las que explicaremos las técnicas de súper-resolución que en los últimos años han roto las barreras impuestas por la física de la luz. Mediante estas técnicas se ha conseguido observar por debajo de los límites de resolución, incluso en muestras vivas.

1. LIMITES DE RESOLUCIÓN ÓPTICA

Cuando la luz entra en un microscopio es refractada por las lentes utilizadas tanto para iluminar como para aumentar y formar la imagen. Pero debido a la naturaleza ondulatoria de la luz y a los efectos de difracción que imponen las lentes se produce un patrón característico de interferencia en la luz observada. Estas interferencias consisten en una serie de regiones iluminadas y oscuras. Este patrón de interferencias producidas por la difracción forma una región central brillante conocida como disco de Airy rodeada de una serie de anillos concéntricos denominados anillos de Airy. De esta manera una molécula fluorescente no se ve como un punto discreto de luz en el plano focal, sino como un pequeño disco de Airy, que además es cientos de veces mayor al tamaño de molécula individual que emite la luz rodeado por anillos concéntricos (anillos de Airy). Pues bien, cuando dos o más moléculas se encuentran juntas, estos discos de luz se sobreponen, dando una imagen cuya resolución es del orden de la longitud de onda de la luz utilizada. Es decir, estos anillos de difracción limitan la capacidad del microscopio óptico de resolver los detalles finos de la muestra. (Ver figura 1).

La potencia de resolución de un microscopio óptico depende de la capacidad del microscopio de distinguir entre dos detalles estructurales adyacentes, sin la interferencia de discos de Airy. Por lo tanto, la potencia de resolución de un microscopio óptico depende de la longitud de onda de la luz utilizada (λ) y de la apertura numérica (NA) de la lente de objetivo. (Ver figura 2).

La distancia mínima para que dos componentes de un sistema puedan diferenciarse con un microscopio es límite de difracción de Abbe. Este límite de difracción es de aproximadamente 200 nm, y fue determinado ya en el año 1873 por Ernst Karl Abbe. Para superar estos límites de resolución es necesario utilizar microscopios electrónicos, donde las muestras deben ser procesadas de tal manera que es completamente imposible observar en muestras vivas.

2. SÚPER-RESOLUCIÓN: Rompiendo los límites de resolución

En el año 2014 se otorgó el Premio Nobel de Química a Eric Betzig, Stefan W. Hell y William E. Moerner por el desarrollo de técnicas novedosas de microscopía óptica de fluorescencia que permiten obtener imágenes de sistemas vivos con una resolución espacial de nanómetros, rompiéndose así, la barrera del límite de difracción de Abbe que la física óptica había impuesto durante toda la historia de la microscopía.

Aunque recibieron el premio en conjunto, los tres investigadores desarrollaron diferentes métodos para lograr resolver las imágenes por debajo del límite de difracción. Por un lado, Stefan Hell desarrolló la técnica de agotamiento de emisión estimulada (STED, por sus siglas en inglés: Stimulated Emission Depletion Microscopy) y, por otro lado William Moerner y Eric Betzig desarrollaron otras técnicas basadas en la localización de moléculas individuales, PALM (Photo-activated localization microscopy o microscopía de localización foto-activada) y STORM (Stochastic optical reconstruction microscopy o microscopía óptica estocástica de reconstrucción).

En próxima Newsletter de microscopía desarrollaremos estas dos técnicas de súper-resolución.

LA ESPECTROMETRÍA DE MOVILIDAD IÓNICA

La movilidad iónica es una técnica analítica que, aunque no es novedosa (Karasek y Cohen, 1970), ha estado cogiendo fuerza en los últimos años como una dimensión extra en la separación iónica en conjunto con la espectrometría de masas (IMS – Ion Mobility Spectrometry).

Esta técnica consiste en la separación de iones a lo largo de un tubo de deriva (drift tube) en función de su movilidad en un gas inerte en presencia de un campo eléctrico. Con lo cual, proporciona información sobre el tamaño, forma y carga de los iones.

Cuando se combina con la espectrometría de masas se convierte en una técnica analítica híbrida con muchas aplicaciones biológicas, farmacéuticas, estructurales o ambientales, entre otras.

Figura 1

La configuración más simple de un tubo de deriva (Figura 1) es en el que una serie de electrodos apilados en forma de anillos tienen un campo de corriente continua estática (CC) aplicado a través de los electrodos. Los iones adquieren una velocidad a lo largo del tubo gobernado por el campo eléctrico y la movilidad del ión en el gas.

Las distintas casas comerciales especializadas en espectrometría de masas han ido implementando la movilidad iónica en diversas configuraciones.

A continuación se presentan dos modalidades de movilidad.

– Trapped Ion Mobility Spectrometry (TIMS):

Los iones son impulsados a través del tubo TIMS con un flujo de gas. Un campo eléctrico controla que cada ion se mueva más allá de una posición definida por la movilidad del ion, donde el empuje que experimenta del flujo de gas coincide con la fuerza del campo eléctrico. Una rampa descendente del campo eléctrico permite la liberación selectiva de iones del tubo según su movilidad.

Figura 2

  • Aplicación en separación de isómeros estructurales (Figura 3):

Figura 3

A- Dos isómeros de pentahidroxyflavonas (Quercetin y Morin) no pueden distinguirse por espectrometría de masas solamente ya que coeluyen en columna cromatográfica. Los datos muestran el pico base cromatográfico de un extracto de propolis (trazo rojo) y el cromatograma de extracción del ión m/z 303.0499 (trazo azul). B- Su diferencia en el patrón conformacional puede ser diferenciada en la dimensión adicional de movilidad. C/D- Una fragmentación subsecuente da un espectro limpio MS/MS de los compuestos. C- Mezcla MS/MS. D- Espectros MS/MS limpios.

  • Artículo:

TimsTOF the next generation of ion mobility mass spectrometry

  • Video de una casa comercial (Bruker) sobre un espectrómetro de masas con movilidad iónica (TIMS):

– Separación de movilidad diferencial (DMS):

DMS es una variante de la espectrometría de movilidad iónica (IMS). La separación está basada en la diferencia entre la movilidad de los iones según los campos eléctricos débiles o fuertes en el gas a presión atmosférica o semejante. Las tensiones de separación (SV) se aplican a lo largo del canal que transporta los iones de modo perpendicular a la dirección del flujo del gas de transporte. Debido a la diferencia entre los coeficientes de movilidad de iones con campo eléctrico débil y fuerte, los iones migran hacia las paredes y abandonan la trayectoria de vuelo. Su trayectoria se corrige con una tensión de corriente para compensar, denominada tensión de compensación (COV).

  1. Adapter ring
  2. SelexION curtain plate
  3. Ion mobility cell
  4. Dual drain assembly
  5. Vaccum interface housing

Figura 4

  • Ion mobility cell:
    1. Especies de iones en corriente de gas
    2. Tensión de separación (SV)
    3. Tensión de compensación (COV)
    4. Iones positivos
    5. Al espectrómetro de masas
    6. Iones negativos

Figura 5

Figura 6

Separación de analitos por Movilidad Diferencial (Figura 6):

(A) En la espectrometría de movilidad iónica tradicional, los iones son impulsados por un campo eléctrico (flecha rosa) a través de un gas (flecha azul), y la separación se basa en las secciones transversales de colisión (CCS) de los iones, la masa, y la carga. (B) En DMS, los iones son transportados por un gas (flecha azul) entre electrodos paralelos (barras grises) y el campo eléctrico se alterna perpendicularmente por el canal (flechas rosadas). Los iones oscilan entre los dos electrodos y pueden salir del tubo o chocar con un electrodo dependiendo de su movilidad diferencial en alto y bajo campo eléctrico. (C) La alternancia de altos y bajos campos eléctricos se obtiene aplicando una forma de onda asimétrica a uno de los electrodos; el máximo campo eléctrico resultante de la forma de onda se llama campo de dispersión y es un parámetro importante para obtener alta resolución. Las duraciones de alto y bajo campo aseguran que sus áreas respectivas debajo de la curva (áreas rosadas) estén igual. Los puntos y líneas de colores representan las trayectorias de los iones que muestran disminución (rojo), constante (verde) o aumento (azul) de la movilidad. (D) Para la separación, se aplica un campo de compensación (CF) a cualquiera de los electrodos, que ajusta la trayectoria de los iones.

  • Aplicación en separación de distintas especies lipídicas (Figura 7):

Esta tecnología fácilmente distingue entre diferentes categorías de lípidos, clases y especies moleculares. Se introdujo un extracto lipídico pulmonar y se aplica una rampa de voltaje de compensación (CoV) en el DMS de -40 a 20V en modo negativo. Todas las especies de fosfatidiletanolamina (PE) se encuentran en el pico CoV a -4.7  y la masa exacta de datos por TOF MS de ese pico puede observarse. Una extracción cromatográfica del pico (XIC) de 750.5446 m / z revela dos picos en el cromatograma correspondiente. El pico más grande es un PE 38:5 y tiene un CoV de -4.4, mientras que el más pequeño es una fosfatidilcolina (PC) 30:0 con un CoV de -8.5.

  • Artículo:

Differential Ion Mobility Separation of Iso-Elemental Lipid Species

  • Video de la casa comercial (Sciex) sobre un espectrómetro de masas con movilidad iónica (DMS):

Bibliografía:

“USO DE LA ESPECTROMETRÍA DE MOVILIDAD IÓNICA COMO TÉCNICA DE VANGUARDIA EN LOS LABORATORIOS ANALÍTICOS DE RUTINA, Tesis Doctoral, Rocío Garrido Delgado” Jiang, W., & Robinson, R. A. S. (2013). Ion Mobility-Mass Spectrometry. Encyclopedia of Analytical Chemistry. doi:10.1002/9780470027318.a9292 

Winter, D. L., Wilkins, M. R., & Donald, W. A. (2018). Differential Ion Mobility-Mass Spectrometry for Detailed Analysis of the Proteome. Trends in Biotechnology. doi:10.1016/j.tibtech.2018.07.018

HIGH THROUGHPUT FLOW CYTOMETRY

La cantidad de células presentes en una muestra es un factor limitante en citometría de flujo. Muestras muy preciadas como las procedentes de líquido cefalorraquídeo o de médula ósea tras una quimioterapia, cuentan con un número de células muy escaso. Por tanto, resulta casi imposible dividir dichas muestras para analizar el mayor número de posible de parámetros y obtener la máxima información de estas.

La citometría multiparamétrica de “high throughput” nos permite analizar en una sola muestra la composición celular, distinguir subpoblaciones celulares heterogéneas así como reconocer una gran cantidad de proteínas (superficiales e intracelulares), incluso en su estado fosforilado. Todos estos parámetros se analizan en paralelo en una misma muestra. 

Sin embargo, existen una serie de desafíos técnicos que surgen a los usuarios de este tipo de citometría. El primero, no tener un citómetro con láseres y detectores suficientes, ya que los citómetros convencionales constan de hasta 4 láseres y son capaces de detectar hasta 13 colores. El segundo, que la necesidad de compensar fluorescencias sea mayor debido al  solapamiento de los espectros de emisión de los fluoróforos.

La necesidad de compensar viene dada fundamentalmente por el espectro de emisión del fluorocromo, ya que el rango de longitud de onda de éste puede solaparse con otro provocando que el equipo recoja fluorescencia en los detectores secundarios. Por esta razón, es muy importante compensar mediante el uso de controles de compensación que contienen cada uno de los anticuerpos por separado, y nos van a ayudar a eliminar la contribución de cada fluorocromo en el resto de detectores (ver Figura 4).

Hoy en día los citómetros más actuales incluyen librerías en las que permiten guardar los espectros de cada fluorocromos una vez han sido analizados por el equipo, evitando así tener que preparar controles con cada experimento y facilitando la compensación. Sin embargo, en los experimentos multiparamétricos sigue siendo complicado compensar debido a que la poca variedad de fluoróforos y detectores hace que solapen más unos con otros.

Estas limitaciones de los citómetros convencionales han contribuido al desarrollo de nuevas formas de citometría que intentan resolver esos problemas: la citometría espectral, que te permite leer el espectro de cada fluorocromo de forma única (como si fuese una firma única que se distingue del resto), y la citometría de masas, que te permite analizar una elevada cantidad de parámetros evitando los problemas de los espectros de emisión al emplear anticuerpos unidos a iones metálicos.

CITOMETRÍA ESPECTRAL

Mientras que la citometría convencional utiliza espejos y filtros para seleccionar un rango de longitud de onda especifico para detectar la señal de diferentes fluorocromos en los tubos fotomultiplicadores (PMTs); la citometría espectral, emplea un sistema óptico dispersivo como los primas o red de difracción (ver Figura 1) para dispersar la luz, que a continuación se recoge a través de una variedad de detectores array. Estos pueden ser fotodiodos de avalancha (APDs) o PMTs con múltiples canales y permiten que se mida el espectro completo de cada partícula creando una especie de “huella digital” de las longitudes de onda que se emiten.

Figura 1. Esquema comparativo entre la citometría convencional y espectral. A la derecha de la imagen observamos los tipos de detectores empleados en citometría espectral, PMTs (ej.: 32 canales del citómetro de Sony Biotecnology) y APDs (ej.: 16 APDs del laser violeta de Cytek Aurora).

Figura 2. Comparación entre la detección convencional de FITC frente a la detección espectral. A) En  citometría convencional solo se recoge de los 515 a 545 nm (filtro 530/30 BP). Sin embargo, B) en citometría espectral se recoge la emisión completa, desde los 490 a los 650 nm, en los múltiples detectores.

Como hemos comentado con anterioridad, los citómetros de flujo espectral capturan el espectro de emisión de la molécula fluorescente, obteniendo más datos de fluorescencia. Esto permite que, las pequeñas diferencias entre moléculas fluorescentes muy similares, que nunca podrían usarse juntas en citometría convencional, como la aloficocianina (APC) y el Alexa Fluor 647, se puedan diferenciar fácilmente en un citómetro espectral tanto de 3 como de 5 láseres. La discriminación entre dichos fluoróforos se basa en las diferencias en sus espectros generales (como se ve en los círculos rojos en la Figura 3) en lugar de en la detección en un canal individual.

Figura 3. Comparación de huellas espectrales entre dos fluorocromos compatibles. Aunque APC y Alexa Fluor 647 se detectan principalmente en rojo, son compatibles cuando se analizan en el citómetro de flujo espectral de 5 láseres Aurora Cytek. Esto es debido a que se observan patrones distintos en los detectores de los láseres ultravioleta, violeta y azul, que permiten discriminar ambas moléculas fácilmente.

En el análisis de citometría de flujo espectral no se compensan las muestras, sino que se lleva a cabo lo que se conoce como spectral unmixing o deconvolución espectral (ver Figura 4). Se basa en la identificación de las huellas espectrales individuales de los fluoróforos en los experimentos multicolor. De esta manera se calcula, mediante algoritmos matemáticos, la contribución del espectro de cada fluoróforo al total de la señal de emisión recogida de cada célula presente en nuestra muestra.

Figura 4. Comparación entre la compensación convencional y la deconvolución espectral.

Dado que el número de fluorocromos disponibles para los investigadores es cada vez mayor (ya se están desarrollando fluoróforos en rojo lejano), el spectral unmixing supone una gran ventaja respecto a la compensación al eliminar la subjetividad y la complejidad que se encuentran asociadas a este método convencional.

CITOMETRÍA DE MASAS (CyTOF)

La citometría de masas o CyTOF (Fluidigm), es una adaptación de un Espectrómetro de Masas de Plasma Acoplado Inductivamente (ICP-MS) al análisis unicelular. En esta variante de la citometría de flujo, las células se tiñen con anticuerpos que están marcados con iones de metales pesados (lantánidos principalmente) ​​en lugar de fluorocromos. Las células teñidas se nebulizan en gotas con una única célula y se introducen en el plasma, ionizándose todos los componentes celulares (C, N, O). La nube de iones cargados resultante se transfiere inmediatamente al cuadrupolo, el cual actúa como filtro permitiendo solo el paso de los iones más pesados con los que han sido marcadas las células. La detección y cuantificación de las células individuales se lleva a cabo mediante un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (TOF). Finalmente, los datos de resultantes se registran en formato de archivo FCS para que puedan visualizarse con cualquier software de citometría de flujo convencional (Figura 7).

Figura 5. Esquema de funcionamiento y componentes de un citómetro de masas.

El empleo de anticuerpos unidos a lantánidos en lugar de fluoróforos, soluciona el problema de la compensación que nos surge al realizar estudios multiparamétricos permitiéndonos distinguir fácilmente subpoblaciones celulares heterogéneas y complejas (como puede ser el sistema inmune), combinando hasta 35 colores de manera simultánea. Sin embargo, se trata de una tecnología mucho más cara y compleja que la citometría espectral.

CONCLUSIONES

La citometría multiparamétrica de “high throughput”, que permite estudiar más de 40 marcadores fluorescentes en una sola muestra, supone el desarrollo de tecnologías más potentes y avanzadas que faciliten la obtención de resultados precisos y específicos, eliminando por ejemplo, el problema de la compensación. Los resultados obtenidos con este tipo de citometría multiparamétrica son enormes y de gran complejidad, lo que conlleva un análisis de datos más complejo (“High-Dimensional Analysis”) que será objeto de futuras newsletters.

Más información:

S.C. Bendall, G.P. Nolan, M. Roederer, P.K. Chattopadhyay. A deep profiler’s guide to Cytometry. Trends Immunol., 33 (2012), pp. 323-332.

http://cytof.scilifelab.se/

https://www.thermofisher.com/es/es/home/life-science/cell-analysis/flow-cytometry/flow-cytometry-learning-center/flow-cytometry-resource-library/flow-cytometry-methods/spectral-flow-cytometry-fundamentals.html

https://cytekbio.com/blogs/resources/tagged/video-tutorials

Seguridad y Funcionamiento en un Laboratorio de Resonancia Magnética de Alto Campo

En esta nueva entrada, dejamos a un lado las técnicas para hablar de seguridad y funcionamiento en un laboratorio de Resonancia Magnética de alto campo. 

A) Información de seguridad

El acceso a la sala tiene que estar regido por unas normas de funcionamiento tanto para la entrada, operación y emergencia en caso de desactivación del imán. Todo el personal que entre tiene que estar informado de estas normas y ser consciente que va a entrar en una zona con altos campos magnéticos la cual entraña un riesgo importante.

Estas normas tienen que aplicarse a:

1) Imán, seguridad y delimitación de la zona

El campo magnético es de 7T, las líneas de fuerza del campo magnético (línea de 5 Gauss) se van a distribuir en un volumen tridimensional alrededor del imán.

Es conveniente señalar o indicar sobre el suelo la distancia que cubre este volumen, de esta manera  nos aseguraremos la zona donde se tienen que extremar las precauciones. Esta delimitación se encuentra a metro y medio del imán.

Concretamente, en nuestro laboratorio la Linea de 5 Gauss se encuentra en toda la sala del equipo.

Área de acceso controlada

Solo podrá entrar personal autorizado que haya sido previamente informado de los riesgos.

– Está prohibida la entrada a todas aquellas personas que lleven implantes metálicos ferromagnéticos, marcapasos o piercings (que no puedan quitarse).

– Antes de entrar en la sala de RM habrá que depositar los teléfonos móviles, relojes, tarjetas con banda magnética, abonos transporte, llaves, monedas, clips, tijeras, pinzas, imperdibles de las etiquetas de las cubetas (todos esos objetos se quedan en los bolsillos y es muy frecuente que se nos olvide depositarlos en el sitio adecuado). En general todos aquellos objetos que sean atraídos por el imán y que puedan actuar de proyectil.

2) Instalación de señales de precaución y advertencia

En la entrada a la sala del imán se colocarán señales informativas de los riesgos y precauciones que supone trabajar con campos magnéticos altos. Estos carteles son suministrados por Bruker y en ellos se informa de la entrada a una zona con un alto campo magnético y con alto nivel de ruido, la entrada restringida a determinadas personas, y objetos que no se pueden introducir. 

3) Plan de emergencia

– Dispositivos físicos de emergencia:

En la sala de control, al lado de la consola existirá un pulsador de emergencia ON/OFF, este dispositivo apagará toda la parte electrónica, sin desactivar el imán, por supuesto.

– Para la desactivación del imán, se colocará un pulsador ROJO señalado como “quench”. Su localización en la sala de RM deber ser conocida y de fácil acceso,  deberá ser pulsado en caso de accidente que implique peligro de vida. Este pulsador,  provoca la desactivación del imán, extrayendo el helio líquido liquido por la chimenea. Una vez pulsado, se saldrá lo más rápido posible de la sala.

– Como medida de seguridad adicional sería deseable instalar unos detectores de concentración de oxígeno. Si el helio por algún motivo, se pudiese evaporar, su volumen aumentaría 760 veces. Esto produciría un aumento de la presión dentro del criostato obligando al helio a salir por la válvula de seguridad. El helio es un gas inodoro, incoloro e insípido y menos denso que el aire. En el caso de que se produjese la evaporación, éste ascendería al techo de la sala, reemplazaría al aire y al respirar, produciría asfixia y congelación, de ahí que sea recomendable instalar el detector de concentración de oxígeno.

4) Instrucciones para el personal de seguridad y de limpieza

La entrada a la sala está prohibida a menos que sean supervisados por el operador de RM y advertirles de los riesgos que conlleva trabajar con altos campos magnéticos. La limpieza de la sala se hará con material que haya sido supervisado previamente por el operador de RM, estando localizado en la misma sala.  Para evitar posibles accidentes, el acceso estará prohibido a este personal.

5) Primeros auxilios y antiincendios

Como todo laboratorio se dispondrá de un extintor contraincendios, uno para sala técnica y un extintor no magnético para la sala del imán.

6) Transporte y almacenaje de líquidos criogénicos

Esta última tecnología de imanes requiere un mantenimiento mínimo de llenado de líquidos criogénicos (Helio líquido). El llenado de Helio será hecho por personal especializado.

7) Monitorización y ventilación del aire en la sala del imán

Es muy importante mantener una buena climatización de la sala, sobretodo en la sala técnica, el aire acondicionado debe mantener la temperatura en torno a los 21ºC tanto en verano como en invierno.

8) Condiciones ambientales de ruido.  

Para evitar el exceso de ruido provocado por los gradientes del imán durante la realización de los experimentos, la puerta entre la sala de control y la del imán ha de permanecer cerrada.  Un ruido adicional y que siempre es constante es el provocado por la toda la electrónica del equipo, por tanto, la puerta de la sala técnica tiene que estar cerrada en todo momento.

Todas estas normas son de aplicación general para cualquier instalación de Resonancia Magnética tanto para la clínica como para la experimental.

Adicionalmente existe una regulación de seguridad tanto por país, como una regulación especifica para trabajar en áreas con altos campos

B) Aspectos básicos de seguridad

1) Leer las instrucciones de seguridad: todos los usuarios deben conocer el manual de seguridad y el plan de emergencia al trabajar con sistemas de Resonancia Magnética.

2) Tener localizado el botón de emergencia on/off situado al lado de la consola.

3) Tener localizado el pulsador rojo para la desactivación del imán (Botón del Quench).

4) Toda persona que entre en la sala debe de tener conocimiento del modo de trabajo en la sala de RM y haber sido instruido (incluido el personal de seguridad y el de limpieza, si acceden a la sala) por la persona responsable del equipo de RM.

5) El usuario además, debe saber la localización del botiquín, extintores, extintores no magnéticos y de todos los dispositivos que tengan que ser utilizados en caso de emergencia.

C) Procedimiento general ante una emergencia

Todos los usuarios y el personal que entre en la sala debe ser capaz de proceder en caso de emergencia. Es decir, deberá saber que:

1) En todas las circunstancias, hay que informar a los miembros responsables de la instalación.

2) En caso de fuego o de descarga eléctrica. Desconectar el sistema inmediatamente  de la red principal por medio del interruptor de emergencia on/off.

3) Si un objeto ha sido atraído por el imán con riesgo de peligro de vida, pulsar inmediatamente el botón de emergencia de quench para desactivar el imán.

4) Si un objeto ha sido atraído por el imán sin riesgo de peligro de vida, no intentar quitarlo. En este caso habrá que avisar al técnico de la casa comercial.

5) Abandonar la sala inmediatamente.

D) Procedimiento en caso de fuego

Recordad que ante cualquier caso de emergencia, siempre habrá que avisar al responsable.

– Si hay fuego en la sala técnica:

Todos los componentes serán apagados con el interruptor de emergencia ON/OFF de la consola o desconectarlo desde cada uno de los sistemas principales. Cada modulo tiene su propio sistema de apagado.

En principio, en la sala técnica si se pueden utilizar los extintores convencionales tomando las respectivas medidas de seguridad. Aún así, sería recomendable tener extintores no magnéticos en las proximidades del equipo de RM.

– Si hay fuego en el interior de la sala del imán:

En este caso, el sistema eléctrico del imán no tiene porqué apagarse inevitablemente. La decisión de apagarlo dependerá del riesgo que ello implique, se utilizará el botón ON/OFF situado al lado de la consola. 

SOLO se pueden utilizar extintores no magnéticos en la zona del imán y estos tienen que estar debidamente marcados como no magnéticos y conocer su localización.

Mientras que el imán esté activo solo se podrá utilizar material no magnético. Si hay que avisar a los bomberos, tener especial cuidado con las máscaras de gas y los equipos de respiración ya que suponen un riesgo de vida. En el caso de que tengan que entrar estos dispositivos, es obligatorio que el imán sea desactivado y que el campo magnético se anule por completo antes de entrar.

E) Procedimiento en caso de una emergencia médica

Si fuese necesaria asistencia médica, ésta deberá producirse fuera de la sala del imán. Si no fuese posible atender a la persona fuera, habrá que desactivar el imán antes de entrar con cualquier equipamiento magnético.