SICS: problemas en la viabilidad y funcionalidad celular tras la separación

¿Has observado alguna alteración en tus células tras separarlas? ¿Cómo podemos conseguir sacar lo mejor de nuestras células separadas?

¿Qué es el SICS?

Sus siglas hacen referencia a Sorter Induced Cellular Stress y, por tanto, es el estrés que sufren las células separadas, a partir de una muestra homogénea, mediante un citómetro separador o cell sorting.

La mayoría de estos citómetros utilizan la separación electroestática para aislar varias poblaciones diferentes con elevada pureza y de forma simultánea.

Sin embargo, el procesamiento previo de la muestra (preparación, tinción, temperatura, etc.) junto con algunos parámetros de la separación (presión, descompresión/expansión, láser, cargas electroestáticas, etc.) someten a las células a numerosas fuerzas mecánicas que originan un estrés en las células aisladas.

¿Qué puede provocar SICS?

  • El proceso de preparación previo a la separación (disgregación de tejidos), puede volver a algunas células más susceptibles al SICS.
  • La gran proporción de celulas muertas en la población inicial.
  • Las condiciones dela separación tamaño del nozzle y presión, van de la mano en la mayoría de las ocasiones. Aunque también pueden cambiar dependiendo del instrumento y la configuración deseada.

Cuando las células son relativamente robustas, la presión puede ser un factor condicionante menor. Sin embargo, cuando son delicadas la presión debe ser la menor posible (Ej.: megacariocito: presión 20 psi y nozzle 100um).

Las células de gran tamaño pueden interrumpir la stream y originar aerosoles. Por ello, el diámetro del nozzle debe ser 3 veces mayor que el diámetro de la célula. Por tanto, es necesario conocer el tamaño de las células que queremos aislar.

  • El uso de tampones incompatibles.

El tampón en el que se encuentra la muestra (o sample tampón) puede ser HBSS, medio de cultivo (sin rojo fenol, puesto que puede dar autofluorescencia), PBS (sin Ca2+/Mg2+) o cualquier otro tampón siempre y cuando contenga los siguientes aditivos:

  • Fuente de proteínas- FBS y/o BSA.
  • HEPES para regular el pH.
  • EDTA para evitar los agregados celulares.
  • DNase para degradar los resto de DNA de las células muertas (cuando haya mucha muerte celular en el procesamiento).

El uso de medio de cultivo como tampón de recogida (o collection tampón ) NO está recomendado, ya que suelen tener en su formulación cloruro de calcio que podría interferir con los fosfatos que componen el fluido envolvente y dar lugar a cristales de fosfato que pueden dañar las células separadas que se encuentran en el tubo de recogida.

  • Duración dela separación.  Las células están sometidas a presión durante largos periodos de tiempo.

¿Cómo podemos identificar que nuestras celulas están sufriendo SICS?

  • La morfología de las células es diferente antes y después de la separación o sorting.
  • Retraso del crecimiento celular después de la separación (post sort). Las células separadas no crecen tan rápido como las que no han sido aisladas.
  • Alteraciones en las funciones de las celulas separadas, pueden retrasarse, disminuir o incluso desaparecer.
  • Se producen cambios en el fenotipo transitoria o incluso, permanentemente.

¿Cómo podemos minimizar SICS?

  • Tras la separación las células forman agregados celulares, debris, mueren -> Esto quizás se deba a que las células no estén bien desde el primer momento. Usa sondas de viabilidad con el fin de monitorizar la muerte celular inicial.
  • Las células mueren -> Intenta:
    • separar en frío
    • incrementa la concentración de suero en el tampón de separación
    • usa tampones similares
    • usa un nozzle de mayor tamaño.
    • Disminuye el tiempo de separación aumentando la velocidad (nozzle más pequeño=mayor presión= menos tiempo de separación=menor volumen recogido y menor dilución del tampón de recogida)
  • La pureza es baja después de cultivar las células separadas -> Las células seleccionadas pueden no crecer tan rápido como las células contaminantes que pueden estar presentes tras la separación.
  • ¿Todavía tienes problemas? -> Cambia la tinción para que la población de interés sea “negativa”.

Resumen…

  • Comienza con una buena preparación de la muestra.
  • Sigue las buenas prácticas.
  • Conoce tus células (observa morfología y tamaño al microscopio antes y después de la separación).
  • Comprende qué requieren las células.

Fuente: “Cell Sorting for Function and Viability”. Seminario impartido por CYTO University (Purdue) International Society for Advancement of Cytometry (ISAC) online. http://cytou.org/store/seminar/seminar.php?seminar=125786

Trainable Weka segmentation. Un plugin de machine learning para FIJI

En este primer artículo del SMAI dentro de la Newsletter de los SAIs queremos hablaros de una posibilidad probablemente desconocida para la muchos de vosotros, que es el uso con FIJI de machine learning para el análisis de vuestras imágenes.

Como sabéis, una de las partes fundamentales  en el análisis de imagen es distinguir los objetos o regiones de interés de nuestras imágenes para poder hacer mediciones sobre ellos. Este proceso se conoce como segmentación de la imagen, en el que clasificamos los píxeles de la imagen en distintas categorías para su posterior estudio. Existen distintas formas de abordar esta segmentación. Una de las más comunes es utilizar un umbral de intensidad para separar lo que consideramos señal positiva del resto. Este es un sistema que funciona bastante bien en determinados tipos de imágenes (como las de fluorescencia) pero que en otras ocasiones (imágenes de campo claro, contraste de fases, etc.) es difícil de aplicar. Aun así, en estos casos suele ser sencillo para nosotros distinguir los distintos objetos de interés al observar las muestras, pero el problema está en conseguir decirle a nuestro programa de análisis cómo separarlos del resto. Aquí es donde viene en nuestra ayuda el plugin Trainable Weka segmentation.

Este plugin nos permite de una manera relativamente sencilla dibujar sobre las imágenes a analizar e indicarle a la máquina la categoría a la que pertenecen esos píxeles sobre los que hemos dibujado. Con esta información la máquina puede empezar a aprender a diferenciar los distintos objetos que hay en la imagen. Por supuesto, los resultados que nos dé se pueden depurar hasta obtener una segmentación adecuada.

Esta es una herramienta muy potente que nosotros ya hemos usado con éxito para identificar automáticamente el área de lesión en vídeos en los que se ha usado el modelo de scratch wound healing.

Aquí tenéis el enlace a la página web del plugin:

https://imagej.net/Trainable_Weka_Segmentation

Y aquí un vídeo donde muestran de una manera muy sencilla su funcionamiento (la explicación comienza alrededor del minuto 70 del vídeo y dura unos 12 minutos):

La entrada del foro a la que hacen mención en el vídeo es esta:

https://forum.image.sc/t/analysis-of-aggregates/303

Y aquí tenéis un par de vídeos más donde trabajan en otros tipos de imágenes:

Esperamos que os haya resultado interesante. Si queréis saber más, no dudéis en preguntarnos.

Comparing SRM and SWATH Methods for Quantitation of Bovine Muscle Proteomes

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PDF

ABSTRACT

Mass spectrometry (MS) has become essential for efficient and accurate quantification of proteins and proteomes and, thus, a key technology throughout all biosciences. However, validated MS methods are still scarce for meat quality research applications. The objective of this work was to develop and compare two targeted proteomic methods, namely, selected reaction monitoring (SRM) and sequential window acquisition of all theoretical spectra (SWATH), for the quantification of 11 bovine muscle proteins that may be indicators of meat color. Both methods require evaluation of spectra from proteotypic and quantotypic peptides, and we here report our evaluation of which peptides and MS parameters are best suited for robust quantification of these 11 proteins. We observed that the SRM approach provides better reproducibility, linearity, and sensitivity than SWATH and is therefore ideal for targeted quantification of low-abundance proteins, while the SWATH approach provides a more time-efficient method for targeted protein quantification of high-abundance proteins and, additionally, supports the search for novel biomarkers.

A Co-registration Pipeline for Multimodal MALDI and Confocal Imaging Analysis of Stem Cell Colonies

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ABSTRACT

Multimodal mass spectrometry imaging (MSI) data presents unique big data challenges in handling and analysis. Here, we present a pipeline for co-registering matrix-assisted laser desorption/ionization MSI and confocal immunofluorescence imaging data for extracting single-cell metabolite signatures. We further describe methods and introduce software for the simultaneous analysis of these concatenated data sets, which are designed to establish a connection between cell traits of interest (shape metrics, position within sample) and the cells’ own metabolic signatures.