LA PROTEÓMICA COMO HERRAMIENTA CLAVE EN EL DIAGNÓSTICO DE LAS ALERGIAS

Alergia, un problema actual

Las enfermedades alérgicas representan una carga creciente para la salud pública a nivel mundial. Su diagnóstico preciso continúa siendo un desafío clínico, especialmente en casos con sintomatología solapada o en reacciones graves como la anafilaxia. En este contexto, la proteómica ha emergido como una herramienta revolucionaria, al permitir el descubrimiento de nuevos biomarcadores, la comprensión profunda de los mecanismos moleculares implicados y la mejora de las estrategias diagnósticas orientadas a la medicina personalizada.

¿Cómo se produce la respuesta alérgica?

Figura 1. Inicio y desarrollo de las respuestas alérgicas. A) Sensibilización a alérgenos y desarrollo de células B y T específicas memoria. (1) La respuesta tiene inicio posterior a la exposición a un alérgeno, el cual será reconocido por las APC y presentado a las células T naive. (2) Esta interacción dará lugar a la diferenciación y expansión clonal de células T helper 2 (Th2). (3) Las células B que reconocen el alérgeno son activadas e interactúan con las células Th2, esta interacción favorece la diferenciación de las células B a células plasmáticas productoras de anticuerpos IgE. (4) La cooperación entre LTh y células B activadas favorece, además, el aumento en la expresión de citocinas como IL-4 y la diferenciación a células Th2. B) Fase temprana de la reacción alérgica (reacción de hipersensibilidad de tipo 1). (1) La IgE en conjunto con los antígenos forma complejos inmunes que se unen a los receptores de IgE de alta afinidad (FcεR1) en los basófilos y mastocitos, provocando la degranulación y liberación de mediadores proinflamatorios. C) Inflamación alérgica (fase tardía de la reacción alérgica). (1) Las exposiciones posteriores a alérgenos provocan el reclutamiento y activación de células inflamatorias y la liberación de mediadores inflamatorios. La presentación de antígenos local facilitada por IgE por las APC aumenta la activación de las células T. Los basófilos y mastocitos favorecen la exacerbación del proceso al expresar histamina, heparina y serotonina. Las células Th1 contribuyen también al proceso inflamatorio. Activación de mastocitos y basófilos, que liberan histamina, quimiocinas y otras citocinas, también contribuyen a la fase tardía de la reacción alérgica. (2) La transición de un estado de inflamación agudo a inflamación crónica está dominada por la activación de células proinflamatorias como LTh1. APC = célula presentadora de antígeno, IFNγ = interferón-γ, IL = interleucina, MHC = complejo mayor de histocompatibilidad, TNF = factor de necrosis tumoral. Créditos Sánchez-Zuno, G. A. et al., 2021 [8].

El papel de la proteómica en alergología

El hecho de que las proteínas desempeñan un papel central en los procesos alérgicos, incluidas las citocinas, alérgenos y receptores de inmunoglobulinas; permiten a la proteómica ofrecer una representación funcional directa del proceso alergénico. Este enfoque permite:

  • Un diagnóstico de mayor precisión al identificar las proteínas específicas asociadas a distintos fenotipos alérgicos, mejorando la estratificación de los pacientes.
  • Descubrir nuevos alérgenos, lo cual es especialmente útil en alimentos complejos o fuentes ambientales emergentes.
  • Revelar biomarcadores clínicos y terapéuticos, ya que caracteriza proteínas útiles para predecir la eficacia de la inmunoterapia, la severidad de la enfermedad y el riesgo de recurrencia.

Principales metodologías proteómicas aplicadas en alergología

  • Electroforesis bidimensional (2D-PAGE)

La electroforesis bidimensional constituye una de las técnicas clásicas y más robustas en proteómica. Permite comparar perfiles proteicos entre pacientes y controles sanos, separando proteínas de un extracto biológico en función del punto isoelétrico y peso molecular. Estos perfiles proteicos generados, también se han empleado en la detección de patrones diferenciales asociados a procesos inflamatorios y permitiendo identificar nuevos alérgenos asociados a alimentos o pólenes, por ejemplo. Además, es muy útil para el estudio de modificaciones postraduccionales relevantes, como la glicación en proteínas de origen alimentario, que puede incrementar su estabilidad frente a la digestión y, por tanto, potenciar su capacidad alergénica.

  • Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

Esta técnica permite separar y purificar proteínas alergénicas de manera eficaz, incluso en matrices biológicas y alimentarias de alta complejidad. Su aplicación en alergología es clave para aislar proteínas alergénicas específicas, facilitando su caracterización estructural. Esto es crucial para llevar a cabo estudios de unión a IgE y ensayos de inmunoterapia.

Asimismo, también se emplea en el análisis cuantitativo de alérgenos en alimentos, esencial para garantizar la seguridad alimentaria y establecer umbrales de exposición seguros en individuos sensibilizados. Por ejemplo, la cromatografía líquida de alta resolución ha permitido identificar proteínas de alta alergenicidad en productos de soja, trigo y cacahuete, incluso tras someterse a tratamientos térmicos o industriales.

  • Espectrometría de masas (MS)

Es fundamental para la identificación de nuevos alérgenos a nivel molecular (como albúminas, oleosinas, etc.). Además, posibilita el mapeo de epítopos IgE, clave para diseñar inmunoterapias más seguras y personalizadas, basadas en evitar péptidos o proteínas hipoalergénicas, y manteniendo aquellas capaces de inducir tolerancia. Otra aplicación destacada es la cuantificación de proteínas en plasma o suero, asociadas a enfermedades respiratorias como la rinitis alérgica, que pueden servir como biomarcadores pronósticos y de respuesta a tratamientos.

En definitiva, la espectrometría de masas ha permitido avanzar desde la mera identificación de alérgenos hasta la comprensión de su papel inmunológico y clínico.

  • Proteómica dirigida y cuantitativa (DIA, PRM, MRM)

Las metodologías de proteómica cuantitativa, como Data Independent Acquisition (DIA/SWATH), Parallel Reaction Monitoring (PRM) o Multiple Reaction Monitoring (MRM), son herramientas de alta sensibilidad y especificidad que permiten cuantificar con gran precisión proteínas de interés previamente conocidas.

En alergología, estas técnicas se aplican para la detección precisa de alérgenos en alimentos procesados, incluso en concentraciones traza, donde la desnaturalización por calor o tratamientos industriales pueden provocar modificaciones estructurales en las proteínas. Esto aumenta la fiabilidad en el etiquetado de productos alimenticios y la protección de pacientes con alergias graves.

También son esenciales en la validación de biomarcadores séricos previamente identificados en estudios de descubrimiento, lo que permite el desarrollo de paneles diagnósticos personalizados.

Finalmente, también permiten el seguimiento longitudinal de pacientes bajo inmunoterapia específica, evaluando la eficacia de los tratamientos mediante la monitorización de proteínas clave asociadas con tolerancia o persistencia de la respuesta alérgica.

Estas metodologías podrían ser el impulso hacia una alergología de precisión, donde el tratamiento se adapta al perfil molecular del paciente.

Algunos ejemplos de proteínas en procesos alergénicos

  • Citocinas Th2 clave: IL‑4, IL‑5 e IL‑13

Estas interleucinas, producidas por linfocitos Th2, eosinófilos, basófilos y células dendríticas, son determinantes en las respuestas alérgicas. Algunas como la IL‑4 e IL‑13, promueven la producción de IgE por los linfocitos B y activan vías inflamatorias en epitelio respiratorio. Otras, como la IL‑5 es fundamental para la diferenciación, activación y reclutamiento de eosinófilos, mediadores centrales en las fases tardías de la inflamación alérgica.

  • Alérgenos alimentarios

Algunas proteínas alergénicas comunes en alimentos reconocidas clínicamente son:

  • 2S álbuminas, 7S/11S globulinas y nsLTPs en frutos secos, semillas, legumbres y frutas.
  • Caseínas, β-lactoglobulina, α-lactalbumina en leche de vaca; ovomucoide, ovalbúmina en huevo; y β-parvalbúmina en pescados como los principales alérgenos IgE mediadas.
  • Tropomiosinas en crustáceos, moluscos y parásitos de pescado, con alta capacidad de reactividad cruzada.

Conclusión

El desarrollo y la implementación de tecnologías proteómicas han permitido un abordaje más preciso, personalizado y predictivo en el diagnóstico y tratamiento de las enfermedades alérgicas. Gracias a su capacidad para identificar biomarcadores funcionales y caracterizar respuestas inmunológicas a nivel molecular, la proteómica contribuye significativamente a la prevención de alergias alimentarias.

La integración de la proteómica con otras disciplinas ómicas (como la genómica y la metabolómica), así como con herramientas de inteligencia artificial, augura una nueva era en la alergología de precisión, donde el tratamiento podrá adaptarse al perfil molecular individual de cada paciente, optimizando así la eficacia clínica y minimizando riesgos.

 AUTORA

Inmaculada Fdez-Cañadas Schez-Aguilera

Técnico titulado superior

Hospital Nacional de Parapléjicos.

Toledo, España.

Referencias

[1] Nguyen, N. T., Järvinen, K. M., Galli, S. J., & Bajic, A. (2024). Plasma proteomic profiling reveals biomarkers associated with anaphylaxis. Frontiers in Immunology, 15, 1328212.  

[2] Zhao, Y., Chen, Z., Li, M., & Wang, S. (2024). Detection and quantification of peanut allergens in complex processed foods using LC–MS techniques. Journal of Agricultural and Food Chemistry.

[3] Picariello, G., Mamone, G., Nitride, C., & Ferranti, P. (2023). Targeted proteomics as a tool to detect allergenic proteins in food matrices. Foods, 12(4), 789.

[4] Venter, C., Brown, K., Maslin, K., & O’Mahony, L. (2023). The role of the gut microbiome and microbial-derived metabolites in food allergy and tolerance. International Journal of Molecular Sciences, 24(3), 2234.

[5] Matricardi, P. M., Kleine-Tebbe, J., Hoffmann, H. J., Valenta, R., Hilger, C., Hofmaier, S., … Ollert, M. (2021). Molecular allergology and component-resolved diagnosis in allergy. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 59(5), 857–868.

[6] García-Casado, G., Crespo, J. F., Barber, D., Rodríguez, J., & Salcedo, G. (2020). Two-dimensional electrophoresis immunoblotting in the diagnosis of food allergy. Food Chemistry.

[7] Sánchez-Zuno, G. A., Oregón-Romero, E., Hernández-Bello, J., González-Estevez, G., Vargas-Rosales, R., & Muñoz-Valle, J. F. (2021). Enfermedades reumáticas y alergias, la dualidad del sistema inmunológico. Revista alergia México, 68(4), 264-275.

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NUEVO ANALIZADOR DE VESÍCULAS EXTRACELULARES Y VECTORES VIRALES

La unidad de Vesículas Extracelulares (UVEx) ha adquirido un nuevo equipo para la caracterización directa de vesículas extracelulares (EVs) procedentes de cualquier muestra biológica así como vectores virales. La tecnología de la plataforma Exoview R100, también conocida como Leprechaun, se basa en interferometría laser y microscopia de fluorescencia.

Este sistema permite el análisis del título, tamaño e inmunofenotipado de nanopartículas individuales de hasta 50 nm.

Posee capacidad para analizar hasta 9 muestras en paralelo, utilizando solamente 35 ul de cada una y sin necesidad de purificación previa.

Además, ofrece la posibilidad de trabajar con kits customizables que permiten la modificación de los anticuerpos de captura para detectar poblaciones de interés.

Os dejamos un video explicativo sobre la plataforma Exoview R100: https://www.unchainedlabs.com/leprechaun/#video

Figura 1. ExoView R100

TECNOLOGÍA

La técnica consiste en incubar la muestra en un chip (denominado Luni por la casa comercial), seguidamente el equipo escanea los Luni de forma automática (unos 8 minutos por chip aprox.) y, por último, los datos se recogen y se procesan en el software de análisis (ExoView Analyzer).

Figura 2. Representación esquemática del funcionamiento del sistema Exoview R100

En la interferometría láser, un haz láser se divide en dos haces con trayectorias diferentes. Estos se recombinan antes de llegar a un detector que mide la distancia recorrida por cada haz de luz y el patrón de interferencia en las ondas dispersas tras impactar una partícula. Mediante el uso de una fuente de luz láser, se pueden medir partículas de hasta 50 nm.

Figura 3. Interferometría láser (SP-IRIS). Sensor de imágenes de reflectancia interferométrica (Oguzhan Avci et al., 2015).

APLICACIONES

CAPTURA, RECUENTO Y TAMAÑO DE EVs

El Exoview emplea una matriz de anticuerpos para capturar las VEs, la cual se basa en la unión a través de proteínas de membrana (ver figura 4), como las tetraspaninas CD9, CD63 y CD81. El equipo mide de forma automática, el tamaño (ver figura 6) y la concentración de la EVs capturadas en cada spot de anticuerpos. Además, podemos emplear un segundo marcaje fluorescente con CD9, CD81 y CD63 (ver figura 5) para confirmar que todas las tetraspaninas están presentes o personalizar el inmunotipado con anticuerpos de interés, tanto de captura como de identificación, usando lo que se denomina kit Flex.

ANÁLISIS DEL CONTENIDO DE EVs

El contenido de las EVs se puede analizar simultáneamente con las proteínas de superficie, el tamaño y el nº de EVs. El único paso adicional en este ensayo sería la permeabilización de las EVs una vez hayan sido capturadas en el Luni. La detección de la proteína luminal de EVs de interés, ocupará uno de los tres canales fluorescentes disponibles. Por tanto, quedarían dos libres para las proteínas de superficie. Como ejemplo, os mostramos la determinación de p-tau, donde se emplea CD171 (molécula de adhesión celular neuronal) como anticuerpo de captura de EVs

Figura 7. Imágenes de los spot en las que las EVs capturadas con CD171 presentan en su lumen la proteína p-tau.

Otro ejemplo de análisis del contenido de EVs, es el estudio de ácidos nucleicos con sondas específicas.

Figura 8. Análisis del contenido en miRNA de EVs mediante Exoview R100.

TITULACIÓN DE LENTIVIRUS

Exoview R100 nos permite obtener una caracterización biofísica completa de cada partícula de lentivirus en cada paso del proceso de producción. Captura hasta 1 x 107 partículas/ml partículas de lentivirus con anticuerpos y analiza sus tamaños, de manera que puede distinguir entre virus individuales y agregados. Además, empleando anticuerpos fluorescentes podemos identificar cuántos virus tienen cápside y, con una sonda específica de ARN, los que contienen este tipo de ácido nucleico.

Figura 9. Titulación, recuento y caracterización de lentivirus mediante Exoview R100.

Os dejamos un video explicativo sobre los ensayos de lentivirus con este equipo:  https://www.unchainedlabs.com/leprechaun/#video

CONCLUSIÓN

La plataforma Exoview R100 se suma a los servicios de la UVEx como una técnica puntera, única en la región,  que permite caracterizar vesículas extracelulares a partir de fluidos biológicos complejos, como plasma, suero, orina o líquido cefalorraquídeo, sin necesidad de aislamiento previo.

Figura 10. Servicios disponibles en la Unidad de Vesículas Extracelulares del HNP. De izquierda a derecha: aislamiento de EVs por ultracentrifugación y cromatografía de exclusion por tamaños, caracterización de EVs por citometría de flujo y western blot, análisis del contenido de EVs mediante espectrometría de masas, caracterización deirecta de EVs mediante Exoview y estudio complete a  partir de cualqueir fluido biológico.

El Hospital Nacional de Parapléjicos incorpora así tecnología de vanguardia que abre nuevas posibilidades en la mejora del diagnóstico y monitorización de enfermedades, así como en el desarrollo de nuevas terapias. Un paso clave hacia una medicina de precisión más cercana al paciente y a la práctica clínica.

AUTORA

Ángela Marquina Rodríguez
Técnico Titulado Superior
Hospital Nacional de Parapléjicos
Toledo, España.

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DESCUBRIENDO EL BIOIMAGE.IO CHATBOT: TU ASISTENTE DE INTELIGENCIA ARTIFICIAL PARA TRABAJAR CON BIOIMÁGENES

En el mundo de la investigación biomédica, las imágenes microscópicas son una fuente de información fundamental. Cada día generamos imágenes de células, tejidos y organismos completos para avanzar en nuestras investigaciones. Sin embargo, analizar estas imágenes de forma precisa puede ser una tarea compleja y muy técnica. Aquí es donde entra en juego el BioImage.IO Chatbot.

¿Qué es el BioImage.IO Chatbot?

El BioImage.IO Chatbot es una herramienta basada en inteligencia artificial diseñada para ayudar a los usuarios en el campo de la bioimagen computacional. Es una especie de «asistente virtual» que permite a investigadores, estudiantes o cualquier persona interesada interactuar con modelos de aprendizaje automático sin necesidad de saber programar.

Desarrollado como parte del ecosistema de BioImage.IO (una plataforma abierta para compartir modelos de deep learning en bioimagen), este chatbot permite al usuario hacer preguntas o pedir ayuda para procesar imágenes, explorar modelos disponibles o entender cómo aplicar uno a sus propios datos. Gracias a la utilización de modelos de lenguaje de gran tamaño (LLMs) y a la información del perfil del usuario (como nombre, ocupación y experiencia), puede ofrecer respuestas relevantes y personalizadas.

Estas son algunas de las tareas que el BioImage.IO Chatbot te puede ayudar a realizar:

Asistencia para la resolución de problemas:

  • Diagnóstico de errores: Si un usuario está teniendo problemas con un script de ImageJ, un flujo de trabajo de análisis en ImJoy, o incluso un modelo de deep learning en deepImageJ, el chatbot puede analizar los mensajes de error y sugerir soluciones. Por ejemplo, podría decir: «El error ‘out of memory’ sugiere que estás procesando una imagen demasiado grande. Intenta reducir el tamaño de la imagen o asigna más RAM a ImageJ.»
  • Optimización de parámetros: Un usuario podría preguntar: «¿Qué parámetros debo usar para segmentar núcleos en estas imágenes de DAPI?» El chatbot, basándose en su conocimiento y quizás en ejemplos previos, podría recomendar un algoritmo (por ejemplo, Otsu, Bernsen) y sugerir rangos de valores para umbrales, tamaños de filtro, etc.
  • Recomendación de herramientas y flujos de trabajo: Si un investigador necesita realizar una tarea específica, como cuantificar la intensidad de proteínas en diferentes compartimentos celulares, el chatbot podría recomendar una serie de pasos: «Para eso, podrías usar ImageJ. Primero, normaliza tus imágenes, luego segmenta los compartimentos usando el plugin X, y finalmente mide la intensidad media en cada uno con la función Y.»

Generación y ejecución de código:

  • Scripts de ImageJ (Macro): Un usuario podría pedir: «Genera un script de ImageJ para abrir una carpeta de imágenes TIFF, convertirlas a 8 bits y guardarlas como PNG.» El chatbot podría generar el código de macro de ImageJ directamente.
  • Scripts de Python (con librerías de bioimagen): Si se le solicita, el chatbot podría generar fragmentos de código Python utilizando librerías populares como scikit-image, NumPy, o OpenCV para tareas como el preprocesamiento de imágenes, la detección de características o la segmentación. Incluso podría sugerir cómo integrar un modelo de bioimage.IO en un script Python.
  • Ejecución remota: La capacidad de «ejecutar código» es clave. Esto significa que el chatbot no solo te da el código, sino que también puede tener la capacidad de ejecutarlo en un entorno de computación, ya sea localmente o en la nube, y mostrarte los resultados (por ejemplo, la imagen procesada o los datos resultantes).

Interacción con equipos de laboratorio (a través de extensiones):

  • Control de microscopios: Esta es una de las capacidades más avanzadas y prometedoras. Imagina poder decirle al chatbot: «Toma una imagen de fluorescencia en el canal GFP con una exposición de 500 ms» y que el chatbot, a través de una extensión y un software de control del microscopio, ejecute esa acción.
  • Automatización de experimentos: Podría ayudar a programar secuencias de adquisición de imágenes, por ejemplo, «Adquiere una serie de imágenes en el tiempo cada 5 minutos durante 2 horas en las posiciones X, Y y Z del pocillo 1.»

Búsqueda y recuperación de información contextual:

  • Modelos de bioimage.IO: Si un usuario está buscando un modelo de deep learning preentrenado para una tarea específica (por ejemplo, segmentación de núcleos de células madre), el chatbot puede buscar en el catálogo de bioimage.IO, identificar modelos relevantes, proporcionar enlaces, y quizás incluso explicar cómo usarlos.
  • Documentación de herramientas: Un investigador podría preguntar: «¿Cómo puedo usar el plugin ‘XYZ’ en ImageJ?» El chatbot buscaría en la documentación de ImageJ.net y proporcionaría instrucciones detalladas o enlaces a tutoriales.

Personalización y aprendizaje:

  • Adaptación al usuario: El chatbot aprende del perfil del usuario (su nivel de experiencia, sus intereses de investigación) y de las interacciones previas. Esto significa que las respuestas se vuelven más relevantes con el tiempo. Si un usuario es un biólogo sin experiencia en programación, el chatbot ofrecerá soluciones más visuales o basadas en interfaces gráficas. Si es un programador, le proporcionará más código y detalles técnicos.
  • Mejora continua: Al ser un proyecto de investigación y desarrollo, el chatbot está diseñado para aprender de las interacciones de los usuarios y ser continuamente mejorado por la comunidad. Esto significa que sus capacidades se expandirán con el tiempo a medida que se agreguen más datos, extensiones y se refinen los modelos subyacentes.

Para todo ello, existen distintos tipos de asistentes que se pueden usar según el tipo de tarea que se quiera llevar a cabo:

  • Melman: Un asistente especializado en la búsqueda de herramientas de análisis de bioimágenes, incluyendo el BioImage Model Zoo, el BioImage Archive, biii.eu y otros, para proporcionar un soporte integral.
  • Nina: Tu tutora para aprender sobre el análisis de bioimágenes e IA. Nina es la guía perfecta, ofreciendo explicaciones detalladas y apoyo a lo largo de tu viaje de aprendizaje.
  • Bridget: Ofrece herramientas para analizar tus imágenes directamente o te ayuda a construir una pipeline de Python para tareas avanzadas de procesamiento de imágenes.
  • Skyler: Facilita la integración de herramientas y flujos de trabajo para el manejo y análisis de bioimágenes, haciendo más fácil aplicar técnicas de análisis avanzadas en tu investigación.

A continuación puedes ver un ejemplo en el que se le pide a Skyler que genere una macro de ImageJ para guardar las imágenes que haya abiertas:

No siempre lo hace bien a la primera:

Lo único que tienes que hacer para utilizarlo es entrar en su página web y registrarte. Se recomienda que rellenes tu información (nombre, ocupación experiencia con bioimágenes, etc.) para ayudar al chatbot a comprender mejor tus necesidades y nivel de conocimiento y que te pueda ofrecer respuestas más personalizadas.

También hay una versión accesible directamente desde chatGPT. Por defecto, el asistente que sale es Melman, pero puedes preguntar a los demás poniendo una arroba antes de su nombre (p.ej.: @Skyler, can you write an imageJ macro to save and close all opened images?)

En resumen, el BioImage.IO Chatbot es una herramienta innovadora que busca transformar la forma en que los biólogos, analistas de bioimágenes y desarrolladores interactúan con las herramientas y datos de bioimagen, haciendo que el análisis de imágenes complejas sea más sencillo y accesible.

¡Os animo a que lo probéis!

BIBLIOGRAFÍA

Lei, W., Fuster-Barceló, C., Reder, G. et al. BioImage.IO Chatbot: a community-driven AI assistant for integrative computational bioimaging. Nat Methods 21, 1368–1370 (2024). https://doi.org/10.1038/s41592-024-02370-y

https://github.com/bioimage-io/bioimageio-chatbot

AUTOR

Javier Mazarío Torrijos
Servicio de Microscopía y Análisis de Imagen
Hospital Nacional de Parapléjicos.
Toledo, España.

NOTA

En la elaboración de este artículo se ha empleado Bioimage.IO chatbot, Gemini y ChatGPT.

Para más información puedes contactar conmigo en: jmazario@sescam.jccm.es

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LA IA CONTRA LA RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS, ¿PODRÁN ANIMALES EXTINTOS SALVARNOS EN EL PRESENTE?

Actualmente existe una crisis que nos tiene a todos los científicos un poco angustiados. La resistencia de patógenos microbianos está a la orden del día y se ha convertido en una prioridad mundial encontrar nuevos fármacos que funcionen. Esta desesperación ha llevado a un investigador español a mirar hacia una fuente inesperada: los organismos extintos. En este artículo, queremos acercaros a un avance muy original que une la paleogenómica con bioinformática e inteligencia artificial (IA): la desextinción molecular, un enfoque pionero liderado por el laboratorio del Dr. César de la Fuente, en la Universidad de Pensilvania.

¿Qué es la desextinción molecular?

La idea principal de la desextinción molecular es traer de vuelta a la vida el potencial terapéutico de especies extintas a partir de sus secuencias genómicas. Gracias a reconstrucción computacional con mapeadores y modelos de IA, el grupo de de la Fuente analiza proteomas extintos para identificar péptidos con propiedades antimicrobianas desconocidas en la actualidad, que posteriormente se sintetizarían artificialmente.

APEX: la IA al servicio de la lucha

Una de las herramientas más importante del equipo es el uso de APEX (Antibiotic Peptide de-Extinction), un sistema de deep learning entrenado para predecir estos péptidos antimicrobianos a partir de proteínas ancestrales. Su rápido análisis masivo de secuencias le hace capaz de seleccionar aquellas con características estructurales y fisicoquímicas asociadas a la actividad antimicrobiana en tiempo récord.

De esta forma, renacieron la mamutusina-2, derivada del mamut lanudo, y la megalocerina-1, del alce gigante Megaloceros giganteus. Ambos péptidos mostraron una gran capacidad bactericida frente a patógenos multirresistentes.

¿Por qué buscar antibióticos en especies extintas?

La biodiversidad extinta presenta una biblioteca molecular inexplorada. Muchas de estas especies desarrollaron defensas químicas únicas para protegerse de infecciones en entornos que hoy están desaparecidos. Además, sus proteínas presentan una arquitectura poco común en los sistemas modernos, lo que podría traducirse en mecanismos de acción distintos a los antibióticos convencionales, evitando también así la dependencia de compuestos de origen natural que se usan actualmente, como los producidos por bacterias del suelo.

Validación experimental y eficacia in vivo

Los péptidos seleccionados por APEX no solo se sintetizan químicamente, sino que son evaluados en ensayos microbiológicos, modelos de infección y estudios de toxicidad, como se hace habitualmente con todos los nuevos fármacos. Algunos de ellos han demostrado una eficacia comparable a la polimixina B, un antibiótico de última línea, pero con menor toxicidad.

Además, estos péptidos muestran resistencia a las estrategias habituales de evasión bacteriana, lo que los convierte en candidatos prometedores frente a superbugs como Acinetobacter baumannii o Klebsiella pneumoniae.

Una nueva frontera en el descubrimiento de fármacos

El trabajo del grupo de César de la Fuente no solo representa un avance tecnológico, sino un cambio de paradigma en la biotecnología antimicrobiana. La combinación de la IA, junto con la síntesis peptídica y los datos genómicos antiguos abre un nuevo capítulo en la lucha contra las infecciones resistentes.

Si bien quedan muchas pruebas que realizar antes de que estos compuestos lleguen al uso clínico, la desextinción molecular sienta las bases para una estrategia de descubrimiento de antibióticos más diversa, evolutivamente informada y resistente a la obsolescencia.

CONCLUSIÓN

La desextinción molecular representa una prometedora estrategia biotecnológica para combatir la creciente amenaza de la resistencia microbiana. Al combinar paleogenómica, IA y la síntesis peptídica, esta línea de investigación abre nuevas posibilidades terapéuticas, aprovechando el legado genético de especies extintas para desarrollar antibióticos más eficaces y duraderos.

AUTORA

María Sánchez Carcelén

Responsable de la Unidad de Bioinformática

Hospital Nacional de Parapléjicos.

Toledo, España.

Referencia

Wan, F., Torres, M.D.T., Peng, J. et al. Deep-learning-enabled antibiotic discovery through molecular de-extinction. Nat. Biomed. Eng 8, 854–871 (2024). https://doi.org/10.1038/s41551-024-01201-x

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REFINAR EL MANEJO Y ALOJAMIENTO DE RATONES

Los ratones de laboratorio derivan del ratón salvaje Mus musculus. Aunque están parcialmente adaptados a la vida en cautiverio, presentan comportamientos y necesidades conductuales similares a los de sus congéneres salvajes. Distintas cepas de ratones de laboratorio pueden mostrar diferencias considerables en la expresión e intensidad de sus comportamientos.

Ratón de campo

Los ratones son más activos al amanecer y al anochecer y pueden cobijarse en refugios y nidos durante el día. Durante sus horas de actividad, dedican su tiempo a comer en periodos cortos y frecuentes, asearse, roer, explorar, trepar, construir nidos y excavar. Los ratones de laboratorio también pueden presentar comportamientos anormales conocidos como estereotipias. Estos comportamientos repetitivos y aparentemente sin función pueden indicar que no se están satisfaciendo las necesidades de bienestar del animal, aunque esto también depende de la cepa.

Manejo de un ratón en manos ahuecadas

Los ratones responden mejor a una habituación suave y a que se les agarre con métodos refinados (es decir, no por la cola). Los ratones acostumbrados a ser manejados mediante métodos refinados (p. ej., un túnel o manos ahuecadas) se estresan menos y son más cooperativos que los ratones a los que se les alza por la cola.

Alojamiento social para ratones de laboratorio

El alojamiento social puede facilitar las necesidades conductuales de los ratones en el entorno de investigación. Se recomienda que, al destetar a los ratones, se alojen con compañeros de camada conocidos. Sin embargo, cuando esto no es factible, por ejemplo, al destetar cepas transgénicas y solo un ratón de la camada tiene el genotipo deseado, se puede utilizar la estrategia del «ratón de compañía». Esta estrategia consiste en mantener un compañero de camada «de compañía» que no sea portador del gen de interés para evitar la necesidad de alojarlos individualmente.

En general, se recomienda mantener a los ratones adultos en grupos estables y evitar la constante retirada e introducción de nuevos individuos, ya que esto podría desestabilizar la jerarquía social establecida.

Los ratones macho pueden ser particularmente territoriales, y la agresión entre machos alojados en grupo puede representar un grave problema de bienestar en el entorno de laboratorio. Se deben tomar medidas para minimizar la agresión entre ratones macho alojados en grupo, lo que puede incluir alojarlos individualmente, esto es preferible cuando la agresión es constante, grave e insoluble.  Si los ratones se alojan individualmente, es esencial proporcionarles material de anidación adicional u otra fuente de calor para que mantengan su temperatura corporal.

Supervivencia de las crías

El entorno social es importante para la supervivencia y el bienestar de las crías. La presencia de dos camadas en una misma jaula con una gran diferencia de edad se ha identificado como un factor que contribuye a la alta mortalidad de las crías. Por lo tanto, se debe tener cuidado de evitar alojar juntas dos o más camadas de diferentes edades, es recomendable alojar temporalmente a las hembras preñadas individualmente antes del parto.

Hembra con un mal nido, crías dispersas por la cubeta indica mala madre

Conviene observar los días previos al parto la construcción del nido lo que ya nos puede indicar que la hembra va a ser una buena madre.

Alojamiento y enriquecimiento

Los ratones deben poder compartimentar su espacio. Por ejemplo, se debe proporcionar agua y comida en un extremo de la jaula, dejando el otro extremo libre para orinar y defecar.

Se debe maximizar el espacio dentro de la jaula para aumentar la complejidad ambiental y el espacio útil, por ejemplo, aprovechando el espacio vertical. Trepar es una actividad locomotora importante en los ratones, que puede facilitarse incorporando una sección de rejilla en la tapa de la jaula. El espacio de la rejilla se limita al comedero en las jaulas ventiladas individualmente; sin embargo, se pueden proporcionar dispositivos adicionales para trepar, como altillos y entrepisos para ratones.

Los ratones prefieren suelos sólidos con lechos adecuados, como virutas de madera. Se debe evitar el uso de suelos de rejilla o malla metálica, ya que pueden causar lesiones. Si se utilizan suelos de rejilla o malla metálica con fines científicos, se debe proporcionar una zona sólida o con lechos para que los animales descansen, a menos que las condiciones experimentales específicas lo impidan.

El enriquecimiento ambiental proporciona estimulación sensorial y motora a los animales en cautiverio y les permite una mayor variedad de actividades y cierto control sobre su entorno. El material de cama y nido, los refugios y los palitos para roer son los recursos de enriquecimiento más utilizados para los ratones y deberían incluirse en todas sus jaulas, a menos que exista una justificación científica sólida para no hacerlo.

Dar a los ratones la oportunidad de realizar comportamientos típicos de la especie, como construir nidos o buscar alimento, puede mejorar significativamente sus vidas en el laboratorio. Roer también es un comportamiento importante para el bienestar de los ratones; dado que sus dientes crecen continuamente a lo largo de su vida, la incapacidad para roer puede  provocar  maloclusión  ( crecimiento  excesivo  de  los  incisivos )  y,  en  consecuencia, desnutrición. Los recintos desolados se asocian con signos de deterioro del bienestar, como ansiedad y comportamiento repetitivo anormal. Durante la cría, se ha demostrado que la falta de enriquecimiento provoca una mayor mortalidad de las crías, una reducción de su peso y un retraso en el desarrollo.

Ratón con maloclusión por crecimiento excesivo de los incisivos

Los ratones prefieren el material de anidación a cualquier otra forma de enriquecimiento. La construcción de nidos es realizada por igual por hembras y machos. Evaluar la calidad del nido es una herramienta valiosa en la jaula para identificar problemas de salud y bienestar (como estrés térmico, agresividad, enfermedad y dolor), y existen protocolos de evaluación de nidos disponibles en la literatura. Incluso los ratones en la etapa preclínica de una enfermedad (es decir, que aún no presentan síntomas clínicos claros) pueden no construir nidos adecuados, si es que logran construir uno.

Proporcionar un material de anidación adecuado puede permitir que incluso las cepas con dificultades para construir nidos (p. ej., ratones C3H) construyan nidos comparables a los de las cepas con mayor capacidad de construcción (p. ej., ratones BALB/c). Además, se debe tener cuidado al elegir el material de anidación para algunos grupos de ratones, como los ratones reproductores o los ratones postoperados, ya que algunos tipos de material de anidación podrían tener un efecto negativo en el bienestar animal. Por ejemplo, las crías y los ratones adultos podrían enredarse y lesionarse con algodón, y los ratones con implantes craneales corren el riesgo de enredarse al intentar construir un nido con papel.

Los ratones muestran preferencias por diferentes materiales de cama, refugios y recursos para roer, que pueden ser específicos de su sexo o raza. Por lo tanto, el enriquecimiento ambiental no debería ser un proceso aleatorio donde se incluyan diferentes objetos en la jaula de un ratón únicamente en función de su disponibilidad, sino que debe evaluarse cuidadosamente su verdadero efecto beneficioso en el bienestar general de los animales.

Recomendaciones para reducir la agresividad

Si bien tanto los ratones machos como las hembras participan en encuentros agresivos, la agresión se reporta y se cita con mayor frecuencia como un problema de bienestar en los machos. Aunque estas recomendaciones se centran en la agresión en ratones machos, parte de la información más general podría aplicarse a ambos sexos.

La agresividad en ratones de laboratorio alojados en grupo se ve influenciada por factores genéticos, sociales y ambientales. Las siguientes recomendaciones ofrecen consejos prácticos sobre los factores que influyen en el comportamiento agresivo de los ratones macho.

Ratón macho herido por sus compañeros de cubeta.

  • Siempre que sea posible, elija cepas con baja prevalencia de agresividad.

Algunas cepas de ratones son más agresivas que otras. Consulte los conocimientos sobre agresividad de la(s) cepa(s) con las que trabaja o planea trabajar. Puede encontrar información sobre tendencias agresivas en línea (p. ej., http://www.mice.jax.org; en la literatura científica) o directamente a través de su proveedor.

Si para los objetivos científicos de su estudio es posible elegir una cepa, es conveniente escoger una que presente una baja prevalencia de agresión. Si es necesario utilizar una cepa más agresiva, es importante conocer los comportamientos específicos de cada cepa.

  • Suministro y transporte

El transporte es un evento importante en la vida de los ratones. Los preparativos y procesos relacionados con el transporte de ratones vivos pueden influir en la prevalencia de comportamientos agresivos una vez que los ratones han llegado a su destino. Por lo tanto, el origen de los ratones puede estar asociado con un aumento de los niveles de agresión.

Si se observa una agresión excesiva en ratones adquiridos de un proveedor determinado, se debe intentar tomar medidas para minimizar la perturbación social y el estrés (por ejemplo, el transporte con compañeros de camada y la adaptación a las cajas de transporte). Si es necesario, solicite información específica sobre el proceso de transporte.

  • Agrupamiento

Hay que establecer grupos estables con compañeros de camada antes de la madurez sexual y minimizar la perturbación social. Al asignar ratones a grupos experimentales hay que hacerlo sin mezclar ratones desconocidos.

La selección de compañeros de jaula entre compañeros de camada se asocia con una menor prevalencia de agresión y un posible mayor bienestar en los ratones machos. Al alojarse en grupos de hermanos del mismo sexo, los animales jóvenes pueden establecer su jerarquía de dominancia desde el principio, y una vez establecida la estabilidad del grupo, no es necesario que haya peleas excesivas. La retirada del individuo dominante provocará peleas para establecer una nueva jerarquía de dominancia.

La introducción del olor de ratones desconocidos también puede perturbar la estabilidad del grupo, por lo que es importante evitarlo al cambiar de jaula. Introducir el olor de ratones hembra en un grupo de machos es un importante desencadenante de agresión que debe evitarse. Hay que separar a los ratones de ambos sexos y limpiar a los machos antes que a las hembras teniendo cuidado con el EPI, la ropa o el equipo que pueda haber estado en contacto con las hembras.

La selección aleatoria de compañeros de jaula se asocia con una mayor prevalencia de agresión. Si se requiere la aleatorización como parte del proceso de asignación para el diseño experimental, esto puede hacerse sin mezclar ratones desconocidos en una jaula.

  • Protocolos de limpieza

Los ratones se comunican mediante olores (señales olfativas) y la presencia de estos olores es importante para mantener la estabilidad social en los grupos. La limpieza de la jaula altera estos olores y altera la jerarquía social. Cuando se cambian las jaulas, la transferencia de material de anidación limpio y seco (pero no de cama sucia) disminuye la prevalencia de la agresión.

  • Enriquecimiento ambiental

Es posible reducir la prevalencia de la agresión en grupos de ratones proporcionando enriquecimiento ambiental que facilite comportamientos específicos de la especie y mejore el bienestar animal. Aumentar la complejidad de la jaula (por ejemplo, proporcionando particiones dentro de la jaula o múltiples túneles) puede dar a los ratones subordinados la oportunidad de alejarse de la vista de un agresor.

Comprensión de los cambios repentinos de comportamiento

Si los niveles de agresividad aumentan repentinamente y se han revisado e implementado las recomendaciones para reducirla, plantearse las siguientes preguntas puede ayudar a identificar la causa del cambio de comportamiento.

¿Se han producido cambios en el entorno general que puedan estar causando estrés a los animales y alterando la estabilidad del grupo?

  • régimen o intensidad de la iluminación
  • niveles de temperatura
  • sonidos ultrasónicos de los equipos
  • olores desagradables de los productos de limpieza
  • la visión, el sonido o el olor de otros animales

¿Se han producido cambios dentro de la jaula que puedan causar estrés a los animales y alterar la estabilidad del grupo?

  • protocolos de agrupamiento
  • limpieza
  • enriquecimiento ambiental, incluye material esencial para la cama y los nidos, y se deben evaluar los cambios en el tipo o la cantidad.
  • Los cambios en la dieta que reciben los animales y en su alimentación también pueden provocar cambios de comportamiento.

¿Qué factores individuales podrían estar provocando mayores niveles de agresividad en algunos ratones?

  • Los animales estresados ​​o con dolor pueden ser más propensos a ser agresivos
  • El método utilizado para marcar ratones puede aumentar los niveles de agresividad
  • los cambios hormonales relacionados con la reproducción

Bibliografía: https://nc3rs.org.uk/3rs-resource-library/

AUTORA

Dra. Mónica Carballo Vila.
Servicio Animalario y Cirugía Experimental
Hospital Nacional de Parapléjicos.
Toledo, España.

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PREDICCIÓN ESTRUCTURAL DE PROTEINAS POR INTELIGENCIA ARTIFICIAL

Descifrando la estructura de las proteínas: un avance revolucionario con AlphaFold

La comprensión de la estructura tridimensional de las proteínas ha sido un desafío fundamental en la biología estructural, con aplicaciones clave en el diseño de fármacos, la biotecnología y la ingeniería de proteínas. Hoy queremos acercaros un avance disruptivo que está transformando este campo: AlphaFold, una innovadora herramienta basada en inteligencia artificial (IA) desarrollada por DeepMind, capaz de predecir con gran precisión la estructura de las proteínas a partir de su secuencia de aminoácidos.

El papel de la proteómica estructural

La elucidación estructural de las proteínas es una aplicación directa de la proteómica estructural, una subdisciplina de la proteómica enfocada en la determinación de la arquitectura tridimensional de las proteínas y sus complejos. La información obtenida no solo permite comprender su función, sino que es crucial para el diseño de fármacos, la biotecnología y el estudio de enfermedades.

Los métodos tradicionales de elucidación estructural

Históricamente, la determinación de estructuras proteicas ha dependido de métodos experimentales avanzados como:

  1. Cristalografía de rayos X – Proporciona estructuras de alta resolución a partir de proteínas cristalizadas.
  2. Espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) – Permite analizar estructuras en disolución, útil para proteínas pequeñas o flexibles.
  3. Crio-microscopía electrónica (crio-EM) – Facilita la visualización de proteínas grandes y complejos proteicos sin necesidad de cristalización.
  4. Espectrometría de masas con modelado computacional – Contribuye a inferir estructuras y modificaciones postraduccionales.

Si bien estos métodos han sido fundamentales, son costosos, requieren grandes cantidades de muestra y pueden tardar meses en obtener resultados.

AlphaFold: el cambio de paradigma

El impacto de AlphaFold ha sido tan profundo que sus desarrolladores, David Baker, Demis Hassabis y John Jumper, han sido reconocidos con el Premio Nobel de Química 2024. Este sistema de IA ha revolucionado la elucidación estructural por sus múltiples ventajas:

  1. Alta precisión – Sus predicciones han demostrado ser comparables a estructuras obtenidas experimentalmente por cristalografía de rayos X o crio-EM.
  2. Velocidad y accesibilidad – Genera estructuras en cuestión de horas o minutos, en contraste con los meses que requieren los métodos tradicionales.
  3. Cobertura masiva – Ha predicho estructuras para prácticamente todas las proteínas conocidas, incluyendo aquellas difíciles de analizar por RMN o cristalización.
  4. Complementariedad con técnicas experimentales – Sus modelos pueden integrarse y validarse con datos experimentales, mejorando su precisión.

AlphaFold vs. Métodos experimentales

Aunque AlphaFold representa un avance sin precedentes, no reemplaza completamente las técnicas experimentales. Existen limitaciones a considerar:

  • No predice directamente interacciones con ligandos o modificaciones postraduccionales.
  • Puede presentar dificultades con estructuras flexibles o complejos proteicos grandes.
  • Las técnicas experimentales siguen siendo esenciales para validar y refinar los modelos generados por IA.

Conclusión

AlphaFold no es solo una herramienta más en la elucidación estructural de proteínas: es un avance que ha transformado la proteómica estructural, democratizando el acceso a modelos proteicos precisos y acelerando el desarrollo de nuevas terapias. Su impacto ya es innegable y seguirá siendo un pilar clave en la biología molecular y el diseño de fármacos en los próximos años.

AUTORA

Alba González Arandilla, MSc.

Especialista en espectrometría de masas.

Hospital Nacional de Parapléjicos.

Toledo, España.

Referencias

  • «Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold» – Nature 2021. Enlace
  • «David Baker, Demis Hassabis y John M. Jumper ganan el Premio Nobel de Química 2024 por ‘descifrar el código de las sorprendentes estructuras de las proteínas'» – BBC News Mundo. Enlace
  • «David Baker, Demis Hassabis y John M. Jumper, Premio Nobel de Química 2024» – Europa Press. Enlace
  • «AlphaFold» – Wikipedia en español. Enlace

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¿CÓMO FUNCIONA LA CITOMETRÍA ESPECTRAL?

Hemos hablado en newsletters anteriores sobre la necesidad cada vez mayor de distinguir, identificar y caracterizar un mayor número de poblaciones y subpoblaciones celulares presentes en una muestra heterogénea compleja, incluso a nivel de célula única, para conocer su funcionalidad y su posible papel en distintas patologías. Asimismo, cobra gran importancia la posibilidad de separar físicamente cada uno de esos subtipos celulares con el fin de estudiarlos en profundidad posteriormente, como por ejemplo mediante diferentes técnicas -ómicas.

La caracterización e identificación de todos estos subtipos celulares en la muestra viene dada por la utilización de múltiples marcadores que caracterizan de forma específica dichas poblaciones. A mayor nº de marcadores/colores utilizados, mayor nº de poblaciones y subpoblaciones se pueden identificar.

La citometría se basa en el uso de anticuerpos o sondas marcadas con fluorocromos, que como todos sabemos, son compuestos químicos con capacidad de absorber luz a diferentes longitudes de onda según un espectro de excitación, y de liberar fotones de luz a longitudes de onda mayores según un espectro de emisión. Los espectros de excitación y emisión son únicos para cada fluoróforo (Fig. 1).

Fig.  1Espectro de excitación y emisión de la phycoeritrin (PE)

En un citómetro convencional, los detectores del equipo mediante el uso de filtros de banda, sólo recogen una parte del espectro de emisión del fluoróforo en cuestión (color azul en Fig.1), que suele coincidir con la zona del espectro de mayor emisión. La citometría espectral, en cambio, se basa en recoger todo el espectro de emisión de un fluoróforo mediante el uso de arrays de detectores que cubren desde longitudes de onda cercanas (350 nm, aprox.) hasta lejanas (900 nm aprox.).


Vamos a ver un poco más en profundidad en qué consiste la citometría espectral y cómo se utiliza en un citómetro separador que además tiene la posibilidad de darnos la imagen de las células (BD-FACS Discovery S8 cellsorter).

TECNOLOGÍA ESPECTRAL

La citometría de flujo convencional utiliza espejos y filtros para seleccionar rangos longitudes de onda específicos (Fig.1), mientras que la citometría de flujo espectral utiliza una matriz de detectores que recoge la luz emitida en un rango entre 350 y 900 nm, lo que permite medir los espectros completos de cada partícula (Fig.2).

Fig.  2. Tecnología espectral. A, esquema del sistema de detectores de un citómetro espectral (Cytek) Espectro de excitación y emisión de la phycoeritrin (PE). B, detección del espectro de emisión de PE por los arrays de detectores. C, firma espectral de la PE

Gracias al sistema de arrays de detectores (Fig.2A), se recoge la señal emitida por cada fluoróforo excitado a diferentes longitudes de onda que emite cada láser(Fig.2B), obteniéndose así una firma espectral única para cada fluoróforo (Fig.2C).

Puesto que se pueden distinguir las firmas espectrales de cada fluoróforo, esto va a permitir que se puedan combinar un nº elevado de colores en un mismo panel de anticuerpos o reactivos, incluso con espectros de excitación y emisión muy parecidos (ej. APC y Alexa Fluor 647), ya que van a tener una firma espectral diferente en la mayor parte de los casos.

Cuando una muestra se adquiere en estos citómetros, para cada una de las células presentes en la muestra se obtiene un espectro de fluorescencia compuesto por los espectros de todos y cada uno de los fluoróforos para los que sean positivas. A continuación, el software del equipo realiza (a tiempo real) una deconvolución espectral, que consiste en comparar los espectros medidos (todas las fluorescencias combinadas) de una célula determinada, con las firmas espectrales de cada fluoróforo por separado y, mediante el uso de un algoritmo,calcula el porcentaje del espectro de cada célula correspondiente a cada fluoróforo por separado (Fig.3). Una vez conocida la intensidad de fluorescencia de cada marcador, la representación gráfica de los datos es igual que en citometría convencional.

Fig.  3.Ejemplo de deconvolución espectral. El software determina la proporción de cada espectro de referencia que se adapta mejor a la muestra completamente teñida

de las ventajas de la citometría espectral es que permite substraer la autofluorescencia, ya que podemos obtener la firma espectral de la autofluorescencia de las células sin teñir y, mediante la deconvolución, substraerla de la señal de cada célula teñida. Esto nos va a permitir tener una mayor limpieza de los datos y detectar fluorescencias de baja intensidad que pueden quedar ocultas por la autofluorescencia de las células.

Con esta tecnología ya existen paneles publicados de hasta 40 colores para una sola muestra.

COMBINACIÓN CITOMETRÍA ESPECTRAL, SEPARACIÓN CELULAR E IMAGEN

Lo mejor de lo mejor es poder combinar múltiples parámetros de forma simultánea, que nos permitan una mejor identificación de poblaciones que queramos separar para ulteriores análisis, como por ejemplo, mediante técnicas –ómicas o de célula única. Si a esto le unimos la posibilidad de tener una imagen de cada una de las células, obtener colocalización de marcadores, etc. tenemos una potente tecnología en nuestras manos.

Con esta idea, BD Biosciences ha lanzado recientemente al mercado el BD FACS Discovery S8 CellSorter con tecnología Cell View.

Este citómetro combina la citometría espectral con la separación celular. Permite separar hasta 6 poblaciones diferentes de forma simultánea, permitiendo la separación en placas multipocillo incluso a nivel de célula única, identificar las células que se han separado en cada pocillo en los gráficos de citometría, e incluso tener una imagen de cada célula con hasta 3 imágenes de fluorescencia.

La tecnología CellView permite, no sólo la visualización de las células, sino también realizar diversos análisis a partir de las imágenes: tamaños, intensidades de fluorescencia, interacciones célula-célula (sinapsis celular), grado de co-localización de fluorescencias, análisis de fagocitosis, etc. Y con todo esto “separar lo que ves, y ver lo que separas”.

CONCLUSIÓN

La citometría espectral es una tecnología que nos permite caracterizar mucho mejor una muestra al utilizar de manera eficiente muchos más fluoróforos (reactivos, anticuerpos), y unida a la separación celular en un citómetro espectral separador, nos permite identificar y purificar poblaciones muy específicas e incluso raras para su posterior estudio profundo.

AUTORA

Virginia Vila del Sol.
Responsable del Servicio de Citometría de Flujo
Hospital Nacional de Parapléjicos.
Toledo, España.

DECLARACIÓN DE NO CONFLICTO DE INTERESES

La autora declara no haber recibido beneficio alguno de BD Biosciences, así como que  la presente newletter no tiene fines publicitarios.

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UNA NUEVA FORMA DE MICROSCOPÍA CONFOCAL: FLIM (Microscopía de imágenes de tiempo de vida de fluorescencia)

La obtención de imágenes confocales es actualmente el estándar en microscopía de fluorescencia aplicada a las ciencias de la vida. Si bien la mayoría de los experimentos de microscopía miden la intensidad de la fluorescencia, FLIM utiliza otra propiedad clave: la duración de la fluorescencia. Esta característica, conocida como tiempo de vida de la fluorescencia, no depende del color (longitud de onda) ni de la intensidad, sino del tiempo que una molécula fluorescente permanece en estado excitado antes de emitir luz.

El tiempo de vida de la fluorescencia es sensible al microambiente del fluoróforo, lo que proporciona información única y valiosa para la investigación. Las imágenes FLIM se consideran funcionales, ya que permiten estudiar no solo la ubicación y concentración de moléculas, sino también su interacción con otras biomoléculas, su actividad, conformación, entorno molecular y modificaciones postraduccionales, todo con alta resolución espacio-temporal.

En resumen, FLIM utiliza el tiempo de vida de la fluorescencia para crear imágenes codificadas por colores según la duración de la fluorescencia del fluoróforo. Estas imágenes combinan información espacial y funcional, añadiendo una dimensión adicional al análisis molecular.

Avances recientes en FLIM

Hasta hace poco, la adquisición de imágenes basadas en el tiempo de vida era considerada lenta, compleja y costosa, especialmente para aplicaciones que involucran células vivas. Sin embargo, los avances en la tecnología FLIM han hecho que este método sea más rápido, accesible y fácil de usar. Esta innovación ha impulsado su aplicación en múltiples áreas de la investigación biológica, destacándose los siguientes campos:

  1. Autofluorescencia molecular. Muchas moléculas endógenas, como NAD(P)H, FAD, aminoácidos y ácidos nucleicos, presentan cierto grado de autofluorescencia. Aunque su intensidad suele ser insuficiente para la microscopía tradicional, FLIM permite obtener imágenes funcionales al medir y codificar la duración de la fluorescencia de estas moléculas. Esta técnica se ha utilizado ampliamente para estudiar el metabolismo y la salud celulares en organismos vivos.
  2. Sensores fluorescentes exógenos. FLIM puede monitorear parámetros microambientales como temperatura, viscosidad, pH y concentración de iones mediante moléculas fluorescentes diseñadas específicamente como sensores.
  3. Discriminación de sondas fluorescentes. FLIM facilita la diferenciación de sondas fluorescentes con espectros de emisión superpuestos, eliminando señales de fondo no deseadas.
  4. Estudios de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). FLIM se utiliza para realizar estudios de FRET más precisos y efectivos, permitiendo analizar interacciones moleculares con mayor sensibilidad.

¿Cómo se realiza FLIM?

El proceso de adquisición de imágenes FLIM se basa en los siguientes pasos:

  1. Medición del tiempo de llegada de fotones. Se mide repetidamente el tiempo entre la excitación láser del fluoróforo y la llegada del fotón de fluorescencia a cada píxel del detector (ver Fig. 1A).
  2. Cálculo del histograma. Se construye un histograma que relaciona el número de fotones detectados con el tiempo de llegada tras el pulso láser (ver Fig. 1B).
  3. Ajuste de la curva de decaimiento. Ajuste de la curva de decaimiento exponencial, F(t) = A0 exp (-t/τ), a cada histograma. La amplitud, F(t), refleja el número total de fotones detectados en un momento específico y la constante de tiempo, τ, se denomina tiempo de vida de la fluorescencia (consulte la figura 1B).
  4. Generación de imágenes codificadas por colores. Los valores de tiempo de vida (τ\tauτ) se codifican por colores, creando una imagen que combina información espacial y funcional (ver Fig. 1C).

Fig. 1 A) Diagrama de la medición del tiempo de llegada de fotones de fluorescencia. B) Histograma de recuentos de fotones en función del tiempo y ajuste de la curva de decaimiento exponencial (τ\tauτ). C) Ejemplo de imagen codificada por colores basada en los valores de tiempo de vida.

Requisitos técnicos

Las imágenes FLIM se adquieren utilizando un microscopio confocal equipado con:

  • Una fuente de excitación láser pulsada.
  • Sistemas de detección basados en el conteo de fotones individuales correlacionados en el tiempo (TCSPC, por sus siglas en inglés).

El TCSPC mide el tiempo entre el pulso láser y la detección del fotón fluorescente, proporcionando información precisa sobre el tiempo de vida de la fluorescencia. De esta forma, los microscopios confocales modernos pueden adquirir imágenes en una dimensión adicional: el tiempo de vida de la fluorescencia, además de la intensidad y longitud de onda de emisión.

AUTOR

José Ángel Rodríguez Alfaro
Responsable del Servicio de Microscopía y Análisis de Imagen
Hospital Nacional de Parapléjicos.
Toledo, España.

Para más información puedes contactar conmigo en: jarodrigueza@sescam.jccm.es

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EVALUACIÓN DE LA SEVERIDAD: UN PROCESO CONTINUO

La “cantidad de daño” que se infringe a los animales en aras de la investigación es un tema que preocupa a la opinión pública. De cara a por una parte a promover una mayor responsabilidad en el uso de los animales y a permitir que el público en general pueda ponderar la justificación de las actuaciones sobre los animales, se ha establecido una clasificación del daño (severidad) que los procedimientos causan a los animales:

Procedimiento sin recuperación: se realizan en su totalidad bajo anestesia general, y los animales no recuperan la consciencia.

Procedimiento leve: son aquellos en los que se espera que los animales experimenten dolor, sufrimiento o angustia poco importantes y que su duración sea corta. En cualquier caso no se prevé una alteración significativa de su bienestar ni de su estado general.

Procedimiento moderado: aquel en el que se prevé que o bien las condiciones que permitirían clasificarlo como leve se prologuen durante un periodo de tiempo más largo o bien las actuaciones serán causa de dolor, sufrimiento o angustia pueden causar una alteración significativa de su bienestar o de su estado general.

Procedimiento severo: aquel en el que se prevé que o bien las condiciones que permitirían clasificarlo como moderado sean duraderas o bien las actuaciones serán causa de dolor, sufrimiento o angustia pueden causar una alteración grave de su bienestar o de su estado general. Para facilitar la clasificación de los procedimientos se han establecidos criterios que permiten su inclusión en una u otra categoría.

  1. PLANIFICACIÓN DEL PROYECTO
  • Cuándo es necesario y está justificado el uso de animales.
  • Deberían identificarse todos los aspectos del estudio que puedan causar dolor, sufrimiento, angustia o daño duradero, y se debería plantear cómo pueden reducirse al mínimo sus efectos.
  • La asignación en la clasificación prospectiva de la severidad de los procedimientos debe estar basada en la severidad más alta prevista para cualquier animal del estudio.
  • Debería elaborarse un plan para observar a los animales que sea adecuado para el estudio y adaptado a este.
  • Es importante contar con personal suficientemente capacitado y competente para realizar el estudio y para encargarse del seguimiento y cuidado de los animales.

El objetivo debe ser lograr la mejor calidad de vida posible para el animal y  asegurar que se reconozca cualquier sufrimiento causado por los procedimientos científicos, y que este se reduzca al mínimo.

Es necesario elaborar una evaluación de la severidad específica para el proyecto, la especie y la cepa. El éxito de cualquier programa de evaluación de la severidad depende de la selección de indicadores de bienestar que:

  • puedan reconocerse fácilmente y de forma fiable.
  • ofrezcan buenos indicadores de bienestar.
  • sean pertinentes al estudio científico, la especie y la cepa.
  • sean prácticos de realizar y no molesten excesivamente al animal.
  • y permitan una medición, una interpretación y un análisis coherentes.

Un sistema común para registrar las observaciones es un objetivo deseable, ya que ayudará a elaborar estrategias coherentes para la clasificación de la severidad. De este modo se facilitará la comparación de resultados clínicos entre estudios e informará a las personas encargadas de la evaluación de la severidad.

Hay que elegir las herramientas de seguimiento, la frecuencia, el tipo de puntuación. Las observaciones se estructuran en las siguientes seis categorías de alto nivel:

  • Aspecto
    • Condición corporal
    • Estado del pelaje y la piel
    • Secreciones
    • Ojos
    • Boca
    • Otros
  • Funciones corporales
    • Respiración
    • Ingesta de comida
    • Temperatura corporal
    • Sentidos
  • Entorno
    • Entrono del recinto incluyendo lecho, material para anidar, elementos de enriquecimiento
  • Comportamientos
    • Interacción social
    • Comportamientos indeseados
    • Postura y movilidad
    • Otros
  • Indicadores específicos del procedimiento
    • Sus posibles efectos adversos y los indicadores previstos de estos
  • Observaciones
    • Anotar cualquier observación de efectos negativos imprevistos del bienestar
  • Criterios de punto final tempranos.
    • Acordar las medidas si se observan signos de dolor, angustia y sufrimiento

En todo procedimiento de investigación es necesario determinar en qué momento debe detenerse el procedimiento en cuestión ya que el daño causado al animal no justifica los beneficios que la continuación reportaría. De acuerdo con la normativa debe establecerse cuál es el umbral del dolor, sufrimiento o angustia que se causará al animal, y una vez superado ese límite el procedimiento debe detenerse.

2. DURANTE EL PROYECTO

  • Coherencia de las observaciones. Personal formado.
  • Seguimiento eficaz diario.
  • Buena comunicación entre todos los participantes.
  • Revisión continúa del protocolo de evaluación en caso necesario.

La evaluación de la severidad real debería llevarse a cabo de forma individualizada, caso por caso, utilizando para ello las observaciones del seguimiento diario de los animales. Asimismo, pueden utilizarse otros parámetros necesarios para los fines del estudio cuando sean pertinentes y estén disponibles. Por ejemplo, para el estudio pueden resultar necesarios indicadores no visibles (como la temperatura y el peso corporal, parámetros bioquímicos o datos biotelemétricos, como la frecuencia cardiaca), que deberían tenerse en cuenta en la evaluación de la severidad si pueden brindar información adicional relevante.

 La severidad real de la que debe informarse para cada animal debería ser el nivel de severidad más alto experimentado durante el procedimiento y no debería determinarse por la severidad al final de este. La evaluación tampoco debería considerarse un simple proceso sumatorio (por ejemplo, varios procedimientos leves equivalen a una severidad moderada). Esta debería basarse en la evaluación global de lo experimentado por el animal desde el inicio hasta el final del procedimiento.

Ejemplos del tipo de elementos que deben tomarse en consideración y ponderarse al evaluar la severidad real.

Procedimiento, técnica:

  • Quirúrgico, no quirúrgico.
  • Nivel y duración del confinamiento.
  • La no administración de analgésicos o anestésicos cuando uno de ellos o ambos en otra situación, serían necesarios.
  • Modelo o procedimiento nuevo
  • Elementos del entorno (como el alojamiento o restricciones de alimento o agua).
  • Estrés o angustia.
  • Procedimientos repetidos e intervalos entre éstos (también deben tenerse en cuenta la frecuencia y la combinación de intervenciones «por debajo del umbral»).

Reutilización o uso continuado.

Especie, cepa, fase de desarrollo, experiencias anteriores:

  • Esta debería ser una consideración importante, pues es necesario comprender la biología y comportamiento de la especie y la cepa (y, en ocasiones, del individuo) para poder predecir y evaluar la severidad de forma eficaz.
  • Especie y cepa.
  • Origen del animal, por ejemplo, criado para experimentación, asilvestrado o salvaje.
  • Proveedor (incluidas las condiciones de alojamiento anteriores) y transporte.
  • Genotipo, fenotipo, sexo, edad, estado inmunitario.
  • Comportamiento normal y biología (por ejemplo, la importancia relativa de los distintos sentidos, como la vista para los primates y el olfato para los roedores, y la forma en que estos pueden verse afectados en el entorno de un laboratorio).
  • Alojamiento individual o en grupo: justificación para aislar animales sociales, o para separarlos de grupos establecidos, a corto o largo plazo.
  • Ritmos diurnos, por ejemplo, el impacto de la realización de procedimientos científicos o técnicos en animales nocturnos durante el día.
  • Separación de la madre en todas las especies, incluidos los roedores.
  • Capacidad cognitiva, consciencia, memoria, percepción de los efectos causados por los procedimientos.

Frecuencia, intensidad:

  • No existe un vínculo directo entre la frecuencia y la severidad, es decir, el aumento de la frecuencia no resulta necesariamente en una mayor severidad. Ello se debe a que el efecto que tiene la repetición de los procedimientos o las técnicas en la severidad depende de varios factores, como la intensidad de cada intervención, su duración, la especie y la experiencia del individuo. 10
  • Si se repiten las intervenciones, puede producirse una aclimatación, lo que puede reducir la severidad, por ejemplo, en un primate sometido a procedimientos leves. En cambio, la repetición puede aumentar la severidad, por ejemplo, debido a la anticipación ante un procedimiento estresante o el desarrollo de hiperalgesia si se realiza cirugía.
  • Se puede llevar a cabo un entrenamiento con refuerzo positivo o «recompensas» tras los procedimientos.
  • Debería registrarse el nivel más alto de severidad y no el «nivel de recuperación».

Duración del efecto:

  • La duración está vinculada a la intensidad (y por consiguiente a la severidad).
  • Si es posible, utilizar puntos finales humanitarios o científicos tempranos.

Eficacia del refinamiento:

  • Analgesia, anestesia y cuidados postoperatorios apropiados.
  • Enriquecimiento: tanto enriquecimiento del entorno como alojamiento en grupo para animales sociales.
  • Alojamiento, cría y cuidados-tanto si es posible refinarlos de acuerdo con las mejores prácticas actuales, como si el procedimiento requiere restricciones, como confinamiento en recintos de menor tamaño (por ejemplo, jaulas metabólicas), suelos de rejilla o exposición a condiciones medioambientales que puedan causar estrés.
  • Entrenamiento del animal para que coopere o facilitar la habituación a los procedimientos.
  • Eficacia de los protocolos de evaluación en el propio alojamiento del animal.

 Severidad acumulativa:

  • En los procedimientos que impliquen varios pasos o intervenciones, deberían tenerse en cuenta lo que experimenta cada animal a lo largo de toda su vida, ya que las limitaciones impuestas a la posibilidad para refinar las condiciones de su alojamiento o la necesidad de capturarlo, manipularlo o confinarlo con frecuencia, etc., pueden influir en la severidad.
  • En caso de reutilización, los procedimientos anteriores.
  • Es necesario tener en cuenta la experiencia a lo largo de toda la vida, que incluye elementos como el origen (por ejemplo, «destete» anticipado) y el transporte, cuando se considera la reutilización.

La asignación final de una categoría de severidad real será resultado de un análisis de los registros de las observaciones del comportamiento, los signos clínicos y otros parámetros pertinentes realizadas en el propio alojamiento del animal.

3. DESPUÉS DEL PROYECTO

El examen de la severidad de un procedimiento debe ser un proceso continuo, desde el diseño inicial del estudio, pasando por el seguimiento específico diario de los animales del estudio durante el proyecto, hasta la evaluación de la severidad «real» al finalizar el estudio, lo que ofrece la oportunidad de identificar nuevos refinamientos para futuros estudios.

Evaluación y puntuación de la severidad real

  • Información estadística
  • Evaluación retrospectiva del proyecto
  • Retroalimentación para futuros estudios
  • Reflejar posibles nuevas aplicaciones de las tres erres
  • Aportaciones a publicaciones científicas

Informes estadísticos anuales del uso de animales en la investigación y docencia

El número de usos de animales con fines científicos y de docencia, así como la forma en que se han realizado esos usos, es una información que se envía anualmente a la autoridad competente, a disposición de aquellas personas que deseen conocer más detalles de la actividad científica. Los datos son proporcionados en primera instancia por los usuarios que los facilitan a sus respectivas autoridades competentes.

NÚMERO DE USOS DE CADA ESPECIE UTILIZADA

Tabla 1: En esta se muestra la cantidad y porcentaje de animales utilizados en los proyectos durante los últimos tres años.

 202120222023
Especie animalNº UsosPorcentaje (%)Nº UsosPorcentaje (%)Nº UsosPorcentaje (%)
Rata33920,5936433,0327535,62
Ratón126977,1071164,5146560,23
Cerdo382,31272,45324,15

De forma general se observa una disminución en el número de animales utilizados, los animales más utilizados son los ratones, esta reducción se observa a pesar de que el número desde proyectos activos en 2023 es mayor que en los años anteriores como vemos en la figura 1.

Figura 1: Número de proyectos activos en los años 2021, 2022 y 2023

Con los datos recogidos en las tablas de bajas que tenemos a disposición de los usuarios podemos conocer la severidad a que se han sometido los animales en el transcurso de los procedimientos, es decir, el grado de dolor, estrés o sufrimiento que han experimentado esos animales. Esta clasificación que se refleja en los datos de baja de los animales debe ser el resultado de la valoración continua, mediante el seguimiento específico diario de los animales durante el desarrollo de los proyectos, hasta determinar la evaluación de la severidad “real”, no debemos olvidar que la severidad que hay que reflejar es la máxima que el animal haya sufrido a lo largo del procedimiento, no la final.

Tabla 2: En esta tabla se representa el número utilizado de cada especie animal y la clasificación de la severidad máxima del procedimiento al que fue sometido.

EspecieSeveridadnº usos 2021nº usos 2022nº usos 2023
RataSin Recuperación134613
Leve000
Moderado000
Severo326318262
RatónSin Recuperación70726777
Leve2212539
Moderado6424
Severo335415325
CerdoSin Recuperación31514
Leve000
Moderado300
Severo321218

El notable descenso en el uso de ratones con una clasificación de sin recuperación y leve se debe a la finalización de dos proyectos en los que se utilizaban ratones transgénicos que se eutanasiaron para el estudio de sus tejidos en el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas.

En la tabla 3 se representa un ejemplo e tabla de puntuación para la valoración de la severidad general, no debemos olvidar que las tablas de puntuación deben ser adaptadas a la especie, la cepa y el procedimiento que se realiza.

Tabla 3: Ejemplo de una hoja de puntuación de supervisión general

  puntuación
Fecha 0= sin perdida1=leve2=Moderado3= Severo
Pérdida peso (en una semana) Peso normalHasta 10%Del 10% al 20%Del 20€ al 35% (Eutanasia)
Aspecto general NormalLigeramente descuidadoFalta acicaladoPiloerección marcada o prolongada. Postura anormal
Comportamiento NormalPequeños cambiosInactividadAutomutilación, vocalizaciones anorrmales, inquietos o inmóviles (Eutanasia)
Comportamiento en respuesta a la manipulación NormalPequeños cambiosCambios moderadosAnimales agresivos o comatosos (eutanasia)
Otras observaciones

Medidas correctoras

0-3: Normal. Supervisión una vez  la semana.

4-8: Supervisión diaria. Posible existencia de dolor o angustia. Uso de analgésicos y/o antiinflamatorios

9-12: Eutanasia.

El uso de animales en investigación es un tema controvertido, no siempre bien informado ni comprendido. Al tiempo que los ciudadanos reclaman tratamientos seguros y eficaces para todas las enfermedades, también se extiende la preocupación por el bienestar animal y piden reducción e incluso supresión de la experimentación con animales. El proceso de evaluación de la severidad debe realizarse correctamente, para que los animales puedan beneficiarse de las mejoras del bienestar animal.

BibliografÍa:

  1. Comisión Europea, Dirección General de Medio Ambiente, Preocupándonos de los animales hacia una ciencia mejor : directiva 2010/63/UE protección de los animales utiliza dos para fines científicos : documento marco para la evaluación de severidad, Oficina de Publicaciones, 2018, https://data.europa.eu/doi/10.2779/646712
  2. https://www.ehu.eus/documents/d/ceid/cuaderno-ceid-re
  3. Real Decreto 53/2013, de 1 de febrero

AUTORA

Dra. Mónica Carballo Vila.
Servicio Animalario y Cirugía Experimental
Hospital Nacional de Parapléjicos.
Toledo, España.

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CITOMETRÍA DE FLUJO COMO NUEVA HERRAMIENTA PARA EL ANÁLISIS DE MICROBIOTA: huella citométrica

La microbiota es el conjunto de microorganismos (bacterias, hongos, arqueas, virus y parásitos) que residen en nuestro cuerpo. La introducción de nuevas técnicas en el análisis de este ecosistema, como la citometría de flujo, supone un gran avance en el conocimiento de la composición de la microbiota y de su implicación en los estados de salud y enfermedad del ser humano.

MICROBIOTA INTESTINAL

El ecosistema microbiano más complejo de nuestro organismo es el asociado al aparato digestivo. Se estima que el intestino humano alberga un total de 1013 bacterias de 400 especies distintas y que llegan a alcanzar un peso de entre 300 y 600 gr.  Su principal función es la de prevenir la colonización por otros microorganismos patógenos, ayudar a digerir los alimentos, producir vitaminas B y K que el organismo humano no es capaz de sintetizar y estimular al sistema inmune. Los cambios en la composición microbiana y, en consecuencia, los cambios en los metabolitos liberados, pueden tener gran impacto en el sistema inmunológico del huésped desencadenando una respuesta inflamatoria. Dichas alteraciones en la microbiota intestinal también se han relacionado con otras enfermedades del sistema nervioso central (autismo, ansiedad, depresión) y con enfermedades neurodegenerativas (Alzheimer, Parkinson, ELA, Enfermedad de Huntington), gracias a las evidencias científicas que han revelado la existencia de una comunicación bidireccional entre el microbioma intestinal y el sistema nervioso central, conocida como “eje microbiota-intestino-cerebro”. Este eje engloba el nervio vago, el sistema parasimpático, los metabolitos bacterianos, que pueden tener acciones como neurotransmisores, y el sistema endocrino asociado al tracto digestivo (Loh et al., 2024).

Tradicionalmente, para la determinación de la composición de la microbiota se han utilizado cultivos microbiológicos. Sin embargo, hoy en día se sabe que la mayor parte de los microrganismo de este ecosistema no se pueden cultivar con los medios habituales, siendo únicamente posible su detección tras la secuenciación de ADN como huella genética.

El conocimiento de este ecosistema se ha incrementado considerablemente tras la utilización de técnicas moleculares de secuenciación masiva, también conocidas como Next-generation Sequencing (NGS). La más utilizada es la amplificación del gen ADNr 16S, que está presente en la mayoría de las especies bacterianas y permite cuantificar la abundancia relativa de cada filo, familia o género. Sin embargo, este gen tiene diferente número de copias en cada género o especie por lo que este método presenta un gran inconveniente y es que tiende a sobreestimar la diversidad microbiana. Además, cabe destacar que esta técnica presenta un coste muy elevado y su estandarización resulta muy compleja.

El análisis de la microbiota por citometría de flujo no presenta esas desventajas, ya que nos permite caracterizar de manera individual las bacterias, analizar la heterogeneidad e incluso la abundancia relativa de cada especie debida a los cambios dinámicos que se producen en la composición y/o funcionalidad microbiana (disbiosis). Aunque no aporte directamente información filogenética, se pueden separar por citometría subpoblaciones bacterianas concretas para posteriores estudios moleculares que permitan determinar el papel de dichas bacterias.

HUELLA CITOMÉTRICA

Los citómetros de flujo de alta resolución permiten analizar la heterogeneidad y los cambios de la microbiota intestinal mediante la medida de la dispersión de la luz (Forwards Scatter) y el contenido de ADN. Para cuantificar el ADN se emplea el colorante 4′,6-diamidino-2′-fenilindol (DAPI), excitable por láser ultravioleta (355nm), que se une a regiones ricas en AT del ADN, permitiendo incluso resolver entre diferentes niveles cromosómicos.

El primer paso consistiría en la obtención de la muestra de la comunidad microbiana (Figura 1A). Esto puede ser, una muestra de heces o una muestra directa del microbioma intestinal. Estas muestras de microbioma (Figura  1B) son comunidades bacterianas diversas que constan de especies con diferentes antecedentes filogenéticos, características celulares y funciones. Para el análisis por citometría de flujo, el ADN de las bacterias se tiñe con DAPI (Figura 1C).

Figura 1. Esquema de los pasos a aseguir para la preparación de muestras en el análisis de microbiota por citometría de flujo. A) Recogida de muestras de la comunidad microbiana; B) Muestras microbiana; C) Tinción del DNA. Figura modificada de Koch et al. 2018.

Las muestras se adquieren por el citómetro de manera individualizada (Figura 2D). Los datos se visualizan en un gráfico biparamétrico, donde dependiendo de la señal de dispersión frontal (FSC) y la fluorescencia del ADN (DAPI), cada célula tendrá una posición específica en el gráfico y las células con características similares estarán más cerca unas de otras. De esta manera, el análisis por citometría representa la huella citométrica del microbioma (Figura 2E). Dicha huella representa la variedad de células con diferentes características ópticas, así como su abundancia en las respectivas subcomunidades (SC). Las SC se pueden identificar basándose en un análisis segregado y están agrupadas mediante gates o regiones (Figura 2F).

Figura 2. Flujo de trabajo en el análisis de microbiota por citometría de flujo. D) Adquición de muestras en el citómetro; E) Huella citométrica; F) Análisis segregado. Figura modificada de Koch et al. 2018

Recientemente, se han desarrollado una serie de herramientas bioinformáticas (flowCHIC, flowEMMi, FlowFP y flowCyBar) que permiten realizar análisis de rutina para revelar la disbiosis. Dichos cambios en la composición bacteriana se puede combinar con información funcional que categorice las muestras según su tratamiento específico, indicación clínica (sano o enfermo) u origen de la muestra (Figura 4G).

El CytBar o Cytometry Barcoding (código de barras citométrico), identifica las variaciones de la huella citométrica y la abundancia de las subcomunidades (SC) a lo largo del tiempo o debidas a factores experimentales (Figura 3H) mediante la aplicación de una plantilla que se aplica a todas las muestras (Figura 3).

Figura 3. Ejemplo de la elaboración de una plantlla de análisis mediante CytBar. Las poblaciones observadas en los dot plot (gráfico de puntos en citometría) se identifican con un gate o región tipo elipsoide. Se combinan los gates de todas las muestras (A y B en la imagen) para generar una plantilla (gate template) que finalmente se aplicará a todas las muestras, gracias a la cual obtendremos la abundancia de bacterias por gate y la indentificación de los cambios producidos en la composición y funcionalidad de las mismas.

Se pueden diferenciar los aumentos (tonos de rojo) y las disminuciones (tonos de azul) del número de bacterias en una SC.  El análisis de correlación revela posibles funciones de las bacterias que conforman cada SC (Figura 4I). El análisis de co-ocurrencia revela interconexiones entre las SC individuales (Figura 4J) (Koch et al., 2018).

Figura 4. Flujo de trajo para el análisis de datos de microbiota adquiridos por citometría de flujo. G) Agrupación de acuerdo a los tratamiento y variaciones en el tiempo; H) CyBar plot: abundancia de las subcomunidades; I) Análisis de correlación; J) Red de co-ocurrencia o red semántica. Figura modificada de Koch et al., 2018.

DIFERENCIAS EN LA HUELLA CITOMÉTRICA DE LA MICROBIOTA DE RATONES SANOS vs COLITIS

Zimmermann J. et al., (2016) detectaron diferencias radicales en la composición de la microbiota fecal durante la colitis murina empleando en su estudio la citometría de flujo. Las poblaciones que diferían entre la huella citométrica de los ratones sanos y los ratones con colitis se aislaron mediante sorter, para la posterior extracción de su DNA  y validación de las diferencias filogénicas mediante la secuenciación del gen ADNr 16S.

En la investigación se emplearon pooles de 12 ratones sanos y 11 ratones enfermos. A estos últimos se les induce la colitis mediante la transferencia de células T. Los ratones fueron sacrificados a las 2-3 semanas de la transferencia  con signos de diarrea y pérdida de peso, en el caso de los enfermos. Las bacterias fecales se aislaron, fijaron con PFA 2% y permeabilizaron con etanol al 70% para mantenerlas a -20ºC hasta futuros análisis. Finalmente, se tiñeron con DAPI durante 3h en oscuridad.

Figura  5. Comparativa de las huellas citométricas detectadas en ratones sanos frente a ratones con colitis. Utilizando los parámetros de dispersión frontal (FSC, eje-x) y el contenido de ADN (DAPI, eje-y) en las bacterias fecales, se detectaron poblaciones bacterianasque difieren en la microbiótica de ambos grupos (Zimmermann J., et al 2016).

Para el análisis de citometría de flujo de las diferentes muestras, se utilizó el flowCyBar, para el cual se realizó una plantilla de gates compuesta por todas las muestras del estudio. En la figura 5 podemos observar como hay dos poblaciones (gates 1 y 2) cuya frecuencia disminuye considerablemente durante la inflamación del colon; mientras que, existe una tercera población (gate 3), que aumenta significativamente en comparación con la microbiota de los mismos ratones antes de la inducción de la colitis. La disbiosis detectada  mediante el análisis de las huellas citométricas, fue validada mediante la separación de los 3 gates por citometría y la secuenciación del gen ADNr 16s en cada uno de ellos.

CONCLUSIÓN

La citometría de flujo de alta resolución se presenta como un método innovador, rápido y económico para la identificación y la cuantificación de especies bacterianas de manera individual. Además, ofrece la oportunidad única de aislar poblaciones bacterianas definidas para análisis moleculares y determinación de funciones adicionales. Todo ello, está contribuyendo a conocer con mayor profundidad las características individuales de la microbiota intestinal y sus modificaciones por factores externos.

En definitiva, la citometría de flujo es una potente herramienta que permite establecer el perfil de ecosistemas bacterianos complejos mediante el análisis de la huella citométrica resultando una herramienta clave en clínica para vincular los cambios dinámicos de la microbiota intestinal con el diagnóstico y pronóstico de enfermedades.

AUTORA

Ángela Marquina Rodríguez
Técnico Titulado Superior
Hospital Nacional de Parapléjicos.
Toledo, España.

Referencias

  1. Loh, J. S., Mak, W. Q., Tan, L. K. S., Ng, C. X., Chan, H. H., Yeow, S. H., Foo, J. B., Ong, Y. S., How, C. W., & Khaw, K. Y. (2024). Microbiota-gut-brain axis and its therapeutic applications in neurodegenerative diseases. Signal transduction and targeted therapy, 9(1), 37. https://doi.org/10.1038/s41392-024-01743-1
  2. Koch, C., Günther, S., Desta, A. F., Hübschmann, T., & Müller, S. (2013). Cytometric fingerprinting for analyzing microbial intracommunity structure variation and identifying subcommunity function. Nature protocols, 8(1), 190–202. https://doi.org/10.1038/nprot.2012.149
  3. Koch, C., Harnisch, F., Schröder, U., & Müller, S. (2014). Cytometric fingerprints: evaluation of new tools for analyzing microbial community dynamics. Frontiers in microbiology, 5, 273. https://doi.org/10.3389/fmicb.2014.00273
  4. Zimmermann, J., Hübschmann, T., Schattenberg, F., Schumann, J., Durek, P., Riedel, R., Friedrich, M., Glauben, R., Siegmund, B., Radbruch, A., Müller, S., & Chang, H. D. (2016). High-resolution microbiota flow cytometry reveals dynamic colitis-associated changes in fecal bacterial composition. European journal of immunology, 46(5), 1300–1303. https://doi.org/10.1002/eji.201646297
  5. Koch, C., & Müller, S. (2018). Personalized microbiome dynamics – Cytometric fingerprints for routine diagnostics. Molecular aspects of medicine, 59, 123–134. https://doi.org/10.1016/j.mam.2017.06.005
  6. Schmiester, M., Maier, R., Riedel, R., Durek, P., Frentsch, M., Kolling, S., Mashreghi, M. F., Jenq, R., Zhang, L., Peterson, C. B., Bullinger, L., Chang, H. D., & Na, I. K. (2022). Flow cytometry can reliably capture gut microbial composition in healthy adults as well as dysbiosis dynamics in patients with aggressive B-cell non-Hodgkin lymphoma. Gut microbes, 14(1), 2081475. https://doi.org/10.1080/19490976.2022.2081475.
  7. Lambrecht, J., Schattenberg, F., Harms, H., & Mueller, S. (2018). Characterizing Microbiome Dynamics – Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities. Journal of visualized experiments : JoVE, (137), 58033. https://doi.org/10.3791/58033

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