La Proteómica como herramiente clave en el diagnóstico de las alergias
Alergia, un problema actual
Las enfermedades alérgicas representan una carga creciente para la salud pública a nivel mundial. Su diagnóstico preciso continúa siendo un desafío clínico, especialmente en casos con sintomatología solapada o en reacciones graves como la anafilaxia. En este contexto, la proteómica ha emergido como una herramienta revolucionaria, al permitir el descubrimiento de nuevos biomarcadores, la comprensión profunda de los mecanismos moleculares implicados y la mejora de las estrategias diagnósticas orientadas a la medicina personalizada.
Precisión estructural de proteínas por inteligencia artificial
Descifrando la estructura de las proteínas: un avance revolucionario con AlphaFold
La comprensión de la estructura tridimensional de las proteínas ha sido un desafío fundamental en la biología estructural, con aplicaciones clave en el diseño de fármacos, la biotecnología y la ingeniería de proteínas. Hoy queremos acercaros un avance disruptivo que está transformando este campo: AlphaFold, una innovadora herramienta basada en inteligencia artificial (IA) desarrollada por DeepMind, capaz de predecir con gran precisión la estructura de las proteínas a partir de su secuencia de aminoácidos.
Una guía para la Imagen por espectrometría de masas MALDI para tejido
En esta newsletter queremos hablaros un poco sobre una técnica analítica ampliamente utilizada, la espectrometría de masas por imágenes (IMS).
Comprender la biodistribución, el metabolismo y la acumulación de fármacos en el cuerpo es un elemento fundamental en investigacióny enel desarrollo farmacéutico.LaIMSes una tecnología de vanguardia que puede proporcionar una amplia información molecular/química sobre biomoléculas, complementaria a la información que se obtiene con otros métodos de análisis espacial de muestras biológicas (Hematoxilina/ eosina (H&E), inmunohistoquímica (IHC)). Su objetivo es detectar los componentes moleculares (metabolitos, péptidos, proteínas) de la muestra, que pueden correlacionarse con las características histológicas y, en última instancia, proporcionar un vínculo molecular fenotípico con la compleja biología de una patología.
SWATH-MS. Estrategias y aplicaciones
En una de nuestras primeras newsletters, os hablábamos sobre la metodología SWATH-MS (Sequential Window Acquisition of All Theoretical Fragment Ion Mass Spectra). Este tipo de tecnología, de adquisición independiente de datos (DIA) de espectros en espectrometría de masas, en estos años se ha revelado como una de las más prometedoras para mejorar la cobertura y la cuantificación de proteínas en mezclas complejas.
En esta newsletter vamos a profundizar un poco más sobre las estrategias y aplicaciones de este enfoque en análisis “ómicos”
Preparación rápida de muestras para estudios multiómicos
Buscando una revisión sobre protocolos para el análisis multiómico (MPLEx), encontramos está revisión que presenta un enfoque simple, eficiente y unificado para preparar lípidos, metabolitos y proteínas para el análisis por espectrometría de masas (MS).
Por regla general, uno de los principales inconvenientes de los métodos MPLEx es el largo proceso de preparación de la muestra que implica la extracción de metabolitos y lípidos con disolventes orgánicos, la precipitación y la digestión durante la noche de las proteínas. Estos procesos son dispares y laboriosos.
La aproximación BAMM (Bead-enabled Accelerated Monophasic Multi-omics) que proponen Muelhlbauer, L. et al, parece una gran alternativa:
Proteómica cuantitativa: Cuantificación basada en MS2
En anteriores newsletters, os hemos ido introduciendo a las diferentes opciones de experimentos en proteómica cuantitativa y la importancia de la identificación y cuantificación integral de todas las proteínas en un sistema biológico, para revelar las funciones de las proteínas en los procesos biológicos, fisiológicos y patológicos. En esta nueva entrega nos enfocamos en los métodos basados en marcaje o proteómica cuantitativa multiplexada, con etiquetado o marcaje químico basada en métodos de adquisición de espectros de MS2.
Cuantificacion Label-Free (LFQ)
En esta newsletter profundizaremos sobre la cuantificación proteica diferencial sin marcaje, la estrategia denominada Label-Free Quantitation (LFQ).
La cuantificación de proteínas label-free es un método para identificar y cuantificar cambios relativos en dos o más muestras biológicas.
Flujo de trabajo
Hay varios pasos fundamentales involucrados en la proteómica cuantitativa label-free, incluida la preparación de muestras (extracción, reducción, alquilación y digestión de proteínas), separación de muestras por cromatografía líquida junto con el análisis por espectrometría de masas en tándem y análisis de datos (identificación de péptidos / proteínas, cuantificación y análisis estadístico). En este caso cada muestra se prepara por separado y luego se somete al análisis individual por LC-MS/MS.
Proteómica cuantitativa: Marcaje químico con isótopos estables
En la anterior newsletter, hicimos una breve introducción a las diferentes opciones de experimentos en proteómica cuantitativa y la importancia de la identificación y cuantificación integral de todas las proteínas en un sistema biológico, para revelar las funciones de las proteínas en los procesos biológicos, fisiológicos y patológicos. En esta nueva entrega nos enfocamos en los métodos basados en marcaje o proteómica cuantitativa multiplexada, con etiquetado o marcaje químico. Estos métodos isotópicos se caracterizan por una mejor reproducibilidad y precisión comparado con los métodos “label-free”. Otra de sus principales ventajas es el multiplexado, que permite analizar en paralelo varias muestras, lo que ahorra tiempo de análisis y aumenta la fiabilidad general del método.
Introducción a la cuantificación proteica diferencial
Una de las técnicas más importantes y desafiantes en proteómica es la cuantificación de las diferencias entre dos o más estados fisiológicos de un sistema biológico.
La pregunta principal a la hora de enfrentarse a un experimento cuantitativo es saber qué método de todos los existentes es el más idóneo para nosotros, por eso en esta newsletter queremos presentar las diferentes opciones que existen.
Primero de todo debemos tener en cuenta que a pesar del increíble impacto de la espectrometría de masas y las técnicas de separación de péptidos en proteómica, la identificación y la cuantificación de todas las proteínas de un sistema biológico sigue siendo un desafío técnico no resuelto. La abundancia proteica y la complejidad de la muestra son factores significativos que afectan la disponibilidad de las proteínas para su cuantificación (Figura 1).
Bottom-up proteomics: Ventajas, inconvenientes y futuro de este campo
El campo de la proteómica consta de una amplia gama de metodología, que ha sido impulsada en gran medida por el desarrollo moderno de la tecnología involucrada. El comienzo de la investigación proteómica se inició debido a desarrollos paralelos en cuatro áreas: (a) electroforesis en gel bidimensional (2D-PAGE), (b) métodos de espectrometría de masas, (c) bases de datos variadas con proteínas catalogadas, y (d) desarrollo de herramientas bioinformática. Hoy nos vamos a centrar en uno de los flujos de trabajo típicos en proteómica, “bottom-up proteomics”. En la revisión que realizan Emmalyn J. Dupree et al (1), presentan este enfoque desde una perspectiva de cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas, donde discuten su desarrollo multidisciplinario, lo bueno y lo malo, y el futuro con la mejora de la metodología actual.
Análisis robusto, reproducible y cuantitativo de miles de proteomas por LC-MS/MS de flujo micro
La cromatografía líquida de nano-flujo ha sido el pilar en la investigación de proteomas durante más de 20 años, principalmente porque los flujos bajos mejoran la ionización de péptidos por electrospray (ESI) por espectrometría de masas (MS) y, por lo tanto, la sensibilidad. Sin embargo, esto tiene como inconveniente el desafío de fabricar columnas reproducibles y duraderas, mantener el electrospray estable durante períodos de tiempo prolongados, realizar cargas cromatográficas rápidas, tener saturación en la espectrometría y, a menudo, largos tiempos improductivos para la transferencia de muestras a velocidades de flujo bajos. Estos factores pueden limitar la reproducibilidad de la identificación y cuantificación de péptidos, así como la exhaustividad, solidez y rendimiento del análisis de proteomas, especialmente cuando se analizan muestras de alta complejidad o amplio rango dinámico de concentraciones de proteínas como ocurre en tejidos y fluidos corporales.
Guía para principiantes
Las recientes publicaciones [1],[2] en las que se resumen fundamentos y estrategias de los conceptos básicos de proteómica basada en espectrometría de masas, nos han hecho recapitular y revisar un poco los recursos y lecturas de interés para aquellos que se inicien en este mundo de la proteómica.
Por ello hacemos una revisión de nuestras fuentes y os dejamos unos cuantos enlaces y reseñas para ir introduciéndose en la espectrometría de masas, los procesos de preparación de muestras y las estrategias de cuantificación y análisis.
La espectrometría de movilidad iónica
La movilidad iónica es una técnica analítica que, aunque no es novedosa (Karasek y Cohen, 1970), ha estado cogiendo fuerza en los últimos años como una dimensión extra en la separación iónica en conjunto con la espectrometría de masas (IMS – Ion Mobility Spectrometry).
Esta técnica consiste en la separación de iones a lo largo de un tubo de deriva (drift tube) en función de su movilidad en un gas inerte en presencia de un campo eléctrico. Con lo cual, proporciona información sobre el tamaño, forma y carga de los iones.
Cuando se combina con la espectrometría de masas se convierte en una técnica analítica híbrida con muchas aplicaciones biológicas, farmacéuticas, estructurales o ambientales, entre otras.
¿Existe el protocolo perfecto?
Algo en lo que insistimos en nuestros cursos de formación y que muchos alumnos nos preguntan es por la preparación de las muestras.
Los más veteranos ya sabréis la respuesta. No, no existe un protocolo perfecto o universal que funcione bien para todo tipo de muestras.
Las condiciones óptimas de preparación deben ser determinadas empíricamente para cada tipo de muestra. Dependiendo de la naturaleza de la muestra (tejido, fluido biológico, células), de la información que queramos obtener y de las técnicas que vayamos a utilizar para resolver nuestro problema biológico, adaptaremos unos métodos de separación, homogeneización, solubilización, limpieza, etc.
SWATH-MS®
SWATH-MS® (Sequential Window Acquisition of All Theoretical Fragment Ion Mass Spectra)
Es un método de adquisición que genera mapas de proteínas globales y cuantitativas utilizando la combinación de la adquisición de datos independientes (DIA) y el análisis de datos específicos, de esta forma, aumenta enormemente el rendimiento de identificación/cuantificación de péptidos en comparación con el ya conocido SRM.
SERVICIOS DE APOYO A LA INVESTIGACIÓN 