Nuevo analizador de vesículas extracelulares y vectores virales
La unidad de Vesículas Extracelulares (UVEx) ha adquirido un nuevo equipo para la caracterización directa de vesículas extracelulares (EVs) procedentes de cualquier muestra biológica así como vectores virales. La tecnología de la plataforma Exoview R100, también conocida como Leprechaun, se basa en interferometría laser y microscopia de fluorescencia.
Este sistema permite el análisis del título, tamaño e inmunofenotipado de nanopartículas individuales de hasta 50 nm.
Posee capacidad para analizar hasta 9 muestras en paralelo, utilizando solamente 35 ul de cada una y sin necesidad de purificación previa.
Además, ofrece la posibilidad de trabajar con kits customizables que permiten la modificación de los anticuerpos de captura para detectar poblaciones de interés.
¿Cómo funciona la Citometría Espectral?
Hemos hablado en newsletters anteriores sobre la necesidad cada vez mayor de distinguir, identificar y caracterizar un mayor número de poblaciones y subpoblaciones celulares presentes en una muestra heterogénea compleja, incluso a nivel de célula única, para conocer su funcionalidad y su posible papel en distintas patologías. Asimismo, cobra gran importancia la posibilidad de separar físicamente cada uno de esos subtipos celulares con el fin de estudiarlos en profundidad posteriormente, como por ejemplo mediante diferentes técnicas -ómicas.
Citometría de flujo como nueva herramienta para el análisis de microbiota: huella citométrica
La microbiota es el conjunto de microorganismos (bacterias, hongos, arqueas, virus y parásitos) que residen en nuestro cuerpo. La introducción de nuevas técnicas en el análisis de este ecosistema, como la citometría de flujo, supone un gran avance en el conocimiento de la composición de la microbiota y de su implicación en los estados de salud y enfermedad del ser humano.
Análisis de viabilidad celular y apoptosis
El procesamiento de una muestra da lugar a una población de células muertas y debris celular, independientemente del protocolo empleado. La eliminación de dichas células del posterior análisis es un paso crítico en citometría de flujo, ya que pueden unir anticuerpo de manera inespecífica, dar autofluorescencia o incluso formar agregados al ser más pegajosas. A diferencia de la necrosis o muerte celular accidental, la apoptosis, o muerte celular programada, es un proceso muy controlado y complejo que se produce de forma natural en las células. A continuación veremos ejemplos de tintes con los que medir viabilidad celular así como ensayos de medida de apoptosis a través de alteraciones en la membrana plasmática o fragmentación de ADN mediante citometría de flujo.
Análisis de la proliferación celular
Una de las funciones celulares más importante es la proliferación celular, ya que es esencial tanto para la supervivencia de las células, como para la regeneración tisular y la reparación. Por tanto, evaluar la respuesta proliferativa a distintos estímulos y/o tratamientos puede ser fundamental para nuestras investigaciones.
La ventaja que supone el uso de la citometría de flujo radica en la rapidez de obtención de resultados, la capacidad de cuantificación y la posibilidad de medir varias propiedades y/o parámetros de forma simultánea.
Análisis de la expresión de RNA por citometría de flujo: Flow-Fish o RNA-Flow
La cuantificación de la producción de RNA mensajero (mRNA) es clave para comprender las respuestas inmediatas de las células a cambios en el ambiente, o en respuesta a un tratamiento. La respuesta celular a diferentes estímulos puede ser muy heterogénea en diferentes células o incluso dentro de la misma población.
Tradicionalmente, la expresión génica se cuantifica analizando el mRNA correspondiente mediante técnicas de RT-PCR cuantitativa, Northern Blot o Hibridación in situ con fluorescencia (FISH), o más recientemente por RNAseq, todas ellas técnicas de punto final que en la mayor parte de los casos requieren la lisis de las células, o al menos la fijación y permeabilización de las mismas.
Citometría de flujo para monitorizar procesos intracelulares II: ROS y potencial de membrana
En la última newsletter de citometría mostramos cómo es posible medir la movilización de Ca2+, así como las concentraciones de magnesio (Mg) y zinc (Zn) mediante citometría de flujo.
En esta segunda entrega de citometría de flujo para monitorizar procesos intracelulares, veremos cómo medir especies reactivas de oxígeno (ROS) y el potencial de membrana mediante citometría de flujo.
- ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO o ROS
Las especies reactivas de oxígeno o ROS son moléculas muy pequeñas y altamente reactivas debido a la presencia de una capa de electrones de valencia no apareada (figura 1). Estas especies se forman de manera natural como subproducto del metabolismo normal del oxígeno, actuando como mensajero secundario de las células al igual que el calcio.
Dependiendo de la concentración, las ROS pueden ser beneficiosas o perjudiciales para las células ya que participan en procesos de señalización celular, homeostasis y apoptosis.
Citometría de flujo para monitorizar procesos intracelulares I: Ca2+, Mg y Zn
La técnica más conocida en citometría de flujo es, sin duda, el inmunofenotipaje. En él se emplean anticuerpos conjugados con fluorocromos que se unen a proteínas celulares y las marcan, permitiendo determinar los diferentes tipos de células presentes en una muestra. Sin embargo, siempre que exista un marcador fluorescente, la citometría de flujo nos va a permitir medir diferentes procesos biológicos.
El más común de estos ensayos es el de movilización de Ca2+. Además del calcio, mediante citometría de flujo es posible medir concentraciones de magnesio (Mg), zinc (Zn), especies reactivas de oxígeno (ROS) e, incluso, el potencial de membrana. En esta primera entrega de citometría de flujo para monitorizar procesos intracelulares, nos centraremos en cómo lograr mediciones precisas de Ca2+ intracelular y hablaremos de las sondas que nos permiten medir Mg y Zn.
Análisis multidimensional
Durante la última década el campo de la citometría de flujo ha desarrollado nuevos avances tecnológicos que han dado como resultado el aumento del número de parámetros que se pueden estudiar, incluso a nivel de célula única.
Tal y como mostramos en las newsletter anteriores, las nuevas técnicas de citometría de masas, citometría espectral, las plataformas de análisis ómicos en célula única y, cómo no, la citometría multiparamétrica convencional (de 8 parámetros en adelante), generan sets de datos muy grandes y con muchas dimensiones, tantas como parámetros se midan (“High Dimensional Data”). Esto hace que el análisis manual con técnicas clásicas manuales se complique.
Citometría genómica, análisis de célula única y multiómica
Las tecnologías de análisis de célula única están proporcionando un conocimiento sin precedentes sobre la complejidad de los sistemas biológicos. Las herramientas clásicas analizan poblaciones celulares en masa y, en consecuencia, una parte de los procesos biológicos permanece invisible. Un ejemplo es la existencia de ciertos tipos celulares que están muy poco representados (raros), pero que pueden tener importantes funciones fisiológicas o patológicas.
Con estas tecnologías, que se vienen desarrollando desde al año 2015, se está encontrando que las poblaciones celulares son más heterogéneas de lo que se había imaginado nunca. Cada célula única es diferente en términos de espacio (posición dentro de un tejido u órgano), tiempo (fase del ciclo celular, estado de activación, fase de desarrollo etc) y perfil molecular.
High throughput flow cytometry
La cantidad de células presentes en una muestra es un factor limitante en citometría de flujo. Muestras muy preciadas como las procedentes de líquido cefalorraquídeo o de médula ósea tras una quimioterapia, cuentan con un número de células muy escaso. Por tanto, resulta casi imposible dividir dichas muestras para analizar el mayor número de posible de parámetros y obtener la máxima información de estas.
La citometría multiparamétrica de “high throughput” nos permite analizar en una sola muestra la composición celular, distinguir subpoblaciones celulares heterogéneas así como reconocer una gran cantidad de proteínas (superficiales e intracelulares), incluso en su estado fosforilado. Todos estos parámetros se analizan en paralelo en una misma muestra.
Vesículas extracelulares
Las vesículas extracelulares (EVs) son pequeñas partículas rodeadas por una bicapa lipídica que son secretadas por todo tipo de células, y que constituyen un mecanismo de comunicación intercelular muy importante. Todas las células que se encuentran creciendo activamente o en una situación de estrés, van a secretar EVs al medio externo.
A lo largo de los años las EVs han recibido multitud de nombres, pero actualmente se recomienda la división en exosomas y microvesículas o ectosomas, atendiendo a su rango de tamaños y a su ruta de biogénesis.
Los exosomas son vesículas de entre 40-100 nm de diámetro secretadas a partir de cuerpos multi-vesiculares (MVB: “Multi-Vesicular Bodies”) generados en el interior celular a partir de endosomas, mientras que las microvesículas o ectosomas tienen tamaños entre 100 nm y 1 µm de diámetro y se producen por evaginación directa de la membrana plasmática.
SICS: problemas en la viabilidad y funcionalidad celular tras la separación
¿Has observado alguna alteración en tus células tras separarlas? ¿Cómo podemos conseguir sacar lo mejor de nuestras células separadas?
¿Qué es el SICS?
Sus siglas hacen referencia a Sorter Induced Cellular Stress y, por tanto, es el estrés que sufren las células separadas, a partir de una muestra homogénea, mediante un citómetro separador o cell sorting.
La mayoría de estos citómetros utilizan la separación electroestática para aislar varias poblaciones diferentes con elevada pureza y de forma simultánea.
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