La unidad de Vesículas Extracelulares (UVEx) ha adquirido un nuevo equipo para la caracterización directa de vesículas extracelulares (EVs) procedentes de cualquier muestra biológica así como vectores virales. La tecnología de la plataforma Exoview R100, también conocida como Leprechaun, se basa en interferometría laser y microscopia de fluorescencia.
Este sistema permite el análisis del título, tamaño e inmunofenotipado de nanopartículas individuales de hasta 50 nm.
Posee capacidad para analizar hasta 9 muestras en paralelo, utilizando solamente 35 ul de cada una y sin necesidad de purificación previa.
Además, ofrece la posibilidad de trabajar con kits customizables que permiten la modificación de los anticuerpos de captura para detectar poblaciones de interés.
Os dejamos un video explicativo sobre la plataforma Exoview R100: https://www.unchainedlabs.com/leprechaun/#video
Figura 1. ExoView R100
TECNOLOGÍA
La técnica consiste en incubar la muestra en un chip (denominado Luni por la casa comercial), seguidamente el equipo escanea los Luni de forma automática (unos 8 minutos por chip aprox.) y, por último, los datos se recogen y se procesan en el software de análisis (ExoView Analyzer).
Figura 2. Representación esquemática del funcionamiento del sistema Exoview R100
En la interferometría láser, un haz láser se divide en dos haces con trayectorias diferentes. Estos se recombinan antes de llegar a un detector que mide la distancia recorrida por cada haz de luz y el patrón de interferencia en las ondas dispersas tras impactar una partícula. Mediante el uso de una fuente de luz láser, se pueden medir partículas de hasta 50 nm.
Figura 3. Interferometría láser (SP-IRIS). Sensor de imágenes de reflectancia interferométrica (Oguzhan Avci et al., 2015).
APLICACIONES
CAPTURA, RECUENTO Y TAMAÑO DE EVs
El Exoview emplea una matriz de anticuerpos para capturar las VEs, la cual se basa en la unión a través de proteínas de membrana (ver figura 4), como las tetraspaninas CD9, CD63 y CD81. El equipo mide de forma automática, el tamaño (ver figura 6) y la concentración de la EVs capturadas en cada spot de anticuerpos. Además, podemos emplear un segundo marcaje fluorescente con CD9, CD81 y CD63 (ver figura 5) para confirmar que todas las tetraspaninas están presentes o personalizar el inmunotipado con anticuerpos de interés, tanto de captura como de identificación, usando lo que se denomina kit Flex.
ANÁLISIS DEL CONTENIDO DE EVs
El contenido de las EVs se puede analizar simultáneamente con las proteínas de superficie, el tamaño y el nº de EVs. El único paso adicional en este ensayo sería la permeabilización de las EVs una vez hayan sido capturadas en el Luni. La detección de la proteína luminal de EVs de interés, ocupará uno de los tres canales fluorescentes disponibles. Por tanto, quedarían dos libres para las proteínas de superficie. Como ejemplo, os mostramos la determinación de p-tau, donde se emplea CD171 (molécula de adhesión celular neuronal) como anticuerpo de captura de EVs
Figura 7. Imágenes de los spot en las que las EVs capturadas con CD171 presentan en su lumen la proteína p-tau.
Otro ejemplo de análisis del contenido de EVs, es el estudio de ácidos nucleicos con sondas específicas.
Figura 8. Análisis del contenido en miRNA de EVs mediante Exoview R100.
TITULACIÓN DE LENTIVIRUS
Exoview R100 nos permite obtener una caracterización biofísica completa de cada partícula de lentivirus en cada paso del proceso de producción. Captura hasta 1 x 107 partículas/ml partículas de lentivirus con anticuerpos y analiza sus tamaños, de manera que puede distinguir entre virus individuales y agregados. Además, empleando anticuerpos fluorescentes podemos identificar cuántos virus tienen cápside y, con una sonda específica de ARN, los que contienen este tipo de ácido nucleico.
Figura 9. Titulación, recuento y caracterización de lentivirus mediante Exoview R100.
Os dejamos un video explicativo sobre los ensayos de lentivirus con este equipo: https://www.unchainedlabs.com/leprechaun/#video
CONCLUSIÓN
La plataforma Exoview R100 se suma a los servicios de la UVEx como una técnica puntera, única en la región, que permite caracterizar vesículas extracelulares a partir de fluidos biológicos complejos, como plasma, suero, orina o líquido cefalorraquídeo, sin necesidad de aislamiento previo.
Figura 10. Servicios disponibles en la Unidad de Vesículas Extracelulares del HNP. De izquierda a derecha: aislamiento de EVs por ultracentrifugación y cromatografía de exclusion por tamaños, caracterización de EVs por citometría de flujo y western blot, análisis del contenido de EVs mediante espectrometría de masas, caracterización deirecta de EVs mediante Exoview y estudio complete a partir de cualqueir fluido biológico.
El Hospital Nacional de Parapléjicos incorpora así tecnología de vanguardia que abre nuevas posibilidades en la mejora del diagnóstico y monitorización de enfermedades, así como en el desarrollo de nuevas terapias. Un paso clave hacia una medicina de precisión más cercana al paciente y a la práctica clínica.
AUTORA
Ángela Marquina Rodríguez
Técnico Titulado Superior
Hospital Nacional de Parapléjicos
Toledo, España.
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