La obtención de imágenes confocales es actualmente el estándar en microscopía de fluorescencia aplicada a las ciencias de la vida. Si bien la mayoría de los experimentos de microscopía miden la intensidad de la fluorescencia, FLIM utiliza otra propiedad clave: la duración de la fluorescencia. Esta característica, conocida como tiempo de vida de la fluorescencia, no depende del color (longitud de onda) ni de la intensidad, sino del tiempo que una molécula fluorescente permanece en estado excitado antes de emitir luz.
El tiempo de vida de la fluorescencia es sensible al microambiente del fluoróforo, lo que proporciona información única y valiosa para la investigación. Las imágenes FLIM se consideran funcionales, ya que permiten estudiar no solo la ubicación y concentración de moléculas, sino también su interacción con otras biomoléculas, su actividad, conformación, entorno molecular y modificaciones postraduccionales, todo con alta resolución espacio-temporal.
En resumen, FLIM utiliza el tiempo de vida de la fluorescencia para crear imágenes codificadas por colores según la duración de la fluorescencia del fluoróforo. Estas imágenes combinan información espacial y funcional, añadiendo una dimensión adicional al análisis molecular.
Avances recientes en FLIM
Hasta hace poco, la adquisición de imágenes basadas en el tiempo de vida era considerada lenta, compleja y costosa, especialmente para aplicaciones que involucran células vivas. Sin embargo, los avances en la tecnología FLIM han hecho que este método sea más rápido, accesible y fácil de usar. Esta innovación ha impulsado su aplicación en múltiples áreas de la investigación biológica, destacándose los siguientes campos:
- Autofluorescencia molecular. Muchas moléculas endógenas, como NAD(P)H, FAD, aminoácidos y ácidos nucleicos, presentan cierto grado de autofluorescencia. Aunque su intensidad suele ser insuficiente para la microscopía tradicional, FLIM permite obtener imágenes funcionales al medir y codificar la duración de la fluorescencia de estas moléculas. Esta técnica se ha utilizado ampliamente para estudiar el metabolismo y la salud celulares en organismos vivos.
- Sensores fluorescentes exógenos. FLIM puede monitorear parámetros microambientales como temperatura, viscosidad, pH y concentración de iones mediante moléculas fluorescentes diseñadas específicamente como sensores.
- Discriminación de sondas fluorescentes. FLIM facilita la diferenciación de sondas fluorescentes con espectros de emisión superpuestos, eliminando señales de fondo no deseadas.
- Estudios de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). FLIM se utiliza para realizar estudios de FRET más precisos y efectivos, permitiendo analizar interacciones moleculares con mayor sensibilidad.
¿Cómo se realiza FLIM?
El proceso de adquisición de imágenes FLIM se basa en los siguientes pasos:
- Medición del tiempo de llegada de fotones. Se mide repetidamente el tiempo entre la excitación láser del fluoróforo y la llegada del fotón de fluorescencia a cada píxel del detector (ver Fig. 1A).
- Cálculo del histograma. Se construye un histograma que relaciona el número de fotones detectados con el tiempo de llegada tras el pulso láser (ver Fig. 1B).
- Ajuste de la curva de decaimiento. Ajuste de la curva de decaimiento exponencial, F(t) = A0 exp (-t/τ), a cada histograma. La amplitud, F(t), refleja el número total de fotones detectados en un momento específico y la constante de tiempo, τ, se denomina tiempo de vida de la fluorescencia (consulte la figura 1B).
- Generación de imágenes codificadas por colores. Los valores de tiempo de vida (τ\tauτ) se codifican por colores, creando una imagen que combina información espacial y funcional (ver Fig. 1C).
Fig. 1 A) Diagrama de la medición del tiempo de llegada de fotones de fluorescencia. B) Histograma de recuentos de fotones en función del tiempo y ajuste de la curva de decaimiento exponencial (τ\tauτ). C) Ejemplo de imagen codificada por colores basada en los valores de tiempo de vida.
Requisitos técnicos
Las imágenes FLIM se adquieren utilizando un microscopio confocal equipado con:
- Una fuente de excitación láser pulsada.
- Sistemas de detección basados en el conteo de fotones individuales correlacionados en el tiempo (TCSPC, por sus siglas en inglés).
El TCSPC mide el tiempo entre el pulso láser y la detección del fotón fluorescente, proporcionando información precisa sobre el tiempo de vida de la fluorescencia. De esta forma, los microscopios confocales modernos pueden adquirir imágenes en una dimensión adicional: el tiempo de vida de la fluorescencia, además de la intensidad y longitud de onda de emisión.
AUTOR
José Ángel Rodríguez Alfaro
Responsable del Servicio de Microscopía y Análisis de Imagen
Hospital Nacional de Parapléjicos.
Toledo, España.
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