Como ya conocéis de seminarios, jornadas y newsletter anteriores (NL21-CITF_04 CITOMETRIA DE FLUJO Y VEs EN LESIÓN MEDULAR Y ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS), las Vesículas Extracelulares (EVs) son unas partículas secretadas por todas las células, que actúan como mecanismo de comunicación intercelular y que tienen un papel importante tanto en procesos fisiológicos como patológicos.
Podemos encontrar estas EVs en todos los fluidos, desde el plasma hasta incluso la leche materna, pudiendo tratarse como posibles biomarcadores en biopsia líquida. Pero lo cierto es que se liberan al medio extracelular y que, por tanto, podemos encontrarlas también dentro de un tejido, donde ejercerán diversas funciones a nivel local.
En esta newsletter nos vamos a centrar en el artículo que lleva por título: “Towards a human brain extracelular atlas: Characteristics of extracelular vesicles from different brain regions, including small RNA and protein profiles”. Aunque este trabajo tiene limitaciones, puede brindarnos algunas pautas para obtener EVs de sistema nervioso, ya que establecen un protocolo para su obtención, que puede ser de aplicación en vuestros futuros estudios.
PROTOCOLO PARA EL AISLAMIENTO/ENRIQUECIMIENTO DE EVs
En este artículo los autores utilizan un único cerebro de un varón de 22 años, cuyas regiones fueron diseccionadas y congeladas a -80ºC con un delay de 13h postmortem. Por tanto, el aislamiento de las EVs tuvo lugar a partir de tejido congelado.En la fig.1 se recogen todos los pasos del procedimiento.
En primer lugar, y como ocurre con la mayor parte de los protocolos para obtención de células del sistema nervioso, se realizó una digestión enzimática, en este caso con colagenasa.
Es importante tener en cuenta que durante la digestión de cualquier tejido, se va a producir muerte celular por el mero procedimiento, con lo que el homogenado resultante, además de EVs contendrá cuerpos apoptóticos y otros restos celulares que en el artículo que nos ocupa, los autores intentan minimizar con los siguientes pasos del protocolo.
El siguiente paso del protocolo consistió en un par de centrifugaciones diferenciales secuenciales: la primera a 300 x g por 10 minutos, con la finalidad de retirar las células (que se pueden utilizar para otro tipo de caracterizaciones por citometría), y el sobrenadante de esta primera centrifugación se centrifuga de nuevo a 2.000 x g 15 minutos, para eliminar los cuerpos apoptóticos y restos celulares grandes.
Con el fin de eliminar lo más posible el debris celular, realizaron una filtración del sobrenadante de la última centrifugación con un filtro de 0.22 µm, y a continuación centrifugaron a 10.000 x g durante 30 min. A esta velocidad de centrifugación, el pellet que se obtiene está enriquecido en vesículas grandes.
A continuación, el sobrenadante se sometió a ultrafiltración para concentrar el volumen mediante el uso de un concentrador de 100 kDa tipo Amicon, y así tener un volumen adecuado para realizar el siguiente paso del protocolo, que fue la separación por cromatografía de exclusión molecular (SEC).
Fig. 1. Esquema del protocolo de aislamiento/enriquecimiento de las Brain-DerivedEVs (bdEVs) y de su caracterización posterior.
RESUMEN DE ALGUNOS RESULTADOS.
En este trabajo se caracterizaron las EVs de 8 regiones diferentes: giro orbitofrontal (ORB), giro post-central (POSTCENTRAL), hipotálamo (HIPPO), tálamo (THAL), giro occipital (OCC), médula (MED), cuerpo calloso (CORP) y cerebelo (CBLM).
De todas estas regiones, la que mayor rendimiento tuvo en cuanto a cantidad de partículas por mg de tejido, fue el CBLM, mientras que el ORB tuvo una menor cantidad de bdEVs recuperadas (Fig.2A). En cuanto al tamaño de las bdEVs, los autores encontraron que las dbEVs derivadas de la médula eran las que mayor tamaño tenían (Fig. 2C y D), mientras que las dbEVs derivadas de ORB y CBLM eran las de menor tamaño.
Fig. 2. Concentración y tamaño de las bdEVs
Para analizar de qué tipos celularesprocedían las bdEVs purificadas, los autores analizaron diversos marcadores neuronales, microgliales, astrocitarios, comunes a todos los tipos celulares y marcadores no neurales mediante técnicas de ELISA (Fig.3).
Fig. 3. Análisis de la expresión de marcadores neurales en las bdEVs, mediante técnica de ELISA.
Se puede ver que, de entre los marcadores neurales, NCAM y CD90 son los que más se expresan en las bdEVs de todas las regiones analizadas, destacando un poco más NCAM en médula. Las bdEVs que expresan más CD271, denominado NGFR, se encuentran producidas en el CBLM.
En cuanto a marcadores astrocitarios, sólo CD44 se detectó en las bdEVs de las distintas regiones, destacando su expresión en la región OCC y en MED.
En este artículo también analizan la expresión de diferentes subtipos de RNA del interior de las bdEVs y determinan mediante análisis del componente principal (PCA) encuentran que existen perfiles de sRNA claramente diferentes entre CBLM, THAL y MED del resto bdEVs procedentes del resto de regiones analizadas.
CONCLUSIÓN
A pesar de que el artículo analizado tiene ciertas limitaciones, sobre todo en cuanto a la utilización de un único paciente como fuente de las bdEVs, que hace que los resultados obtenidos en cuanto a abundancia de bdEVs, expresión de marcadores o de RNAs no sean concluyentes, este trabajo proporciona un protocolo para obtener EVsa partir de un tejido que puede ser de gran utilidad en el futuro. Es necesaria la validación de estas observaciones en tejido de más pacientes, pero la metodología podrá permitirnos estudiar el origen y la posible función de las EVs producidas in situ.
AUTOR
Virginia Vila del Sol.
Responsable del Servicio de Citometría y Unidad de Vesículas Extracelulares
Hospital Nacional de Parapléjicos.
Toledo, España.
Referencias
Y. Huang, T. Arab, A. E. Russell, E. R. Mallick, R. Nagaraj, E. Gizzie, J. Redding-Ochoa, J. C. Troncoso, O. Pletnikova, A. Turchinovich, D. A. Routenberg, K. W. Witwer, Interdiscip. Med. 2023, 1, e20230016. https://doi.org/10.1002/INMD.20230016
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