Es una herramienta genética que permite eliminar o activar la función de cualquier gen en las diferentes células de un ratón, organismo modelo por excelencia. Se utiliza para crear diferentes de modelos de ratón: knockouts específicos de tejido, knockouts generales, knockouts inducibles y encender genes fluorescentes o informadores.
¿QUÉ ES EL CRE-LOX?
Este sistema se tomó del mecanismo de recombinación del Bacteriófago P1, el cual inserta y retira su genoma del genoma de la bacteria mediante el uso de la recombinasa «Cre» que reconoce a las secuencias de nucleótidos que reciben el nombre de sitios LoxP
Durante el ciclo de vida viral del bacteriófago, el fago se adhiere al exterior de la pared bacteriana y luego, una vez adherido, inyecta su ADN en el citoplasma de la bacteria. A continuación, el ADN del fago debe circularizarse para que el huésped lo replique.
Este bacteriófago tiene codificado en su propio genoma las enzimas necesarias para circularizar su ADN, así como secuencias diana de recombinación específicas. Este sistema natural tiene la capacidad única para hacer cortes específicos en el ADN y ligar el ADN de nuevo.
VENTAJAS DEL SISTEMA CRE-LOX
- Permite a los investigadores enfocarse en porciones del genoma de forma controlable, en un lugar específico y en un momento específico. Esta tecnología permite supresiones de ADN muy específicas y dirigidas al mismo tiempo, lo que permite regular cuándo o dónde se elimina un gen.
- También puede permitir a los investigadores la capacidad de evaluar la función de un gen en un tipo de tejido específico.
SISTEMA CRE-LOX
El sistema Cre-lox tiene dos componentes principales: la recombinasaCre y su secuencia objetivo, los sitios loxP. La Crerecombinasa es una enzima que genera roturas de ADN de doble cadena dentro secuencias específicas y liga las hebras de nuevo.
Las secuencias de ADN que se reconocen se denominan sitios loxP. Un sitio loxP tiene 34 pares de bases de largo y consta de dos repeticiones invertidas de 13 pb que flanquean una secuencia central de 8 pares de bases.
Dos moléculas de recombinasaCre se unen a cada una de las secuencias repetidas.
MECANISMOS CRE-LOX
Dependiendo de cómo estén orientados los sitios loxP en el genoma, el sistema Cre-lox puede servir para generar una delección (ambos orientados en la misma dirección) o una inversión (orientados en diferente dirección). El sentido lo otorga la secuencia interna azul flanqueada por las secuencias rojas invertidas.
https://www.credly.com/org/the-jackson-laboratory/badge/cre-lox-technology-in-mouse-modeling
DELECCIÓN
Ambos orientados en la misma dirección
Mecanismo básico de Cre-lox para la eliminación de genes se debe insertar dos sitios loxP que flanquean la región a eliminar. Dependiendo de dónde se inserten y su orientación se pueden obtener diferentes tipos de eliminaciones.
Por lo general, se insertan estos sitios utilizando técnicas de recombinación homóloga a partir de células madre embrionarias que luego se utilizan para crear un ratón. Pero también se podría usar la tecnología CRISPR para eliminar los pasos de células madre embrionarias y crear modelos en una variedad de fondos genéticos eliminando el gen en ovocitos fertilizados. Cuando inserta los dos sitios loxP dentro de un gen, comúnmente nos referimos a eso como gen floxed, que es la abreviatura de flanked by loxP.
En presencia de Cre recombinasa, Cre se unirá a cada sitio loxP formando un tetrámero, y las dos hebras de ADN se emparejarán. La recombinasa Cre entonces hace un corte a mitad de camino a través de ambos sitios de reconocimiento en la secuencia central, y luego, liga las dos mitades de los diferentes sitios juntos. Como resultado, generará un episoma que contiene la pieza de ADN que será eliminado (Knock-out)
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INVERSIÓN
El sistema Cre-lox también se puede utilizar para crear inversiones cromosómicas esto se logra colocando los sitios loxP en una orientación inversa.
Cuando los sitios loxP se encuentran de esta manera, al emparejarse el ADN y la recombinasa el ADN se corta de tal manera que no se une la secuencia flanqueada, sino que intercambia los extremos y voltea la secuencia. Esto implica que la secuencia del gen ya no está dentro del sentido del promotor lo que lleva al silenciamiento del gen pero sin perderlo.
Si se reintroduce la recombinasa el gen puede activarse nuevamente (Knockout, inducible y reversible)
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Además, si el transgen Cre está bajo el control de un promotor tejido-específico, la inactivación del gen se presentaría únicamente en tejidos específicos (knock-out condicional), permitiendo ratones genéticamente modificados de manera endógena.
Debido a que muchos genes inactivados por knock-out pueden ser esenciales para el desarrollo embrionario, esta tecnología sirve para evitar el problema de las metodologías mencionadas anteriormente.
Por ejemplo, si se emplea un ratón donde el gen de la adrenomedulina está “floxeado”, cuando estos ratones se cruzan con otros que portan la proteína Cre controlada por un promotor específico para neuronas, la proteína Cre se expresará sólo en neuronas y en estas células se producirá la ablación del gen de la adrenomedulina. Sin embargo, en el resto de células no se producirá la ablación del gen a pesar de que en todas ellas el gen está “floxeado”, ya que en estas células no se expresa la proteína Cre. De esta forma se obtienen ratones que viven sin problemas, ya que tienen una expresión relativamente normal de adrenomedulina, pero cuyas neuronas carecen de este gen, permitiendo el estudio detallado de las funciones del gen de la adrenomedulina en el sistema nervioso (Lack of adrenomedullin in the mouse brain results in behavioral changes, anxiety, and lower survival under stress conditions. Fernandez et al., 2008).
Obviamente, una vez que se tiene una línea de ratones con un gen “floxeado”, ésta se puede cruzar con distintos transgénicos para conseguir la delección del gen en distintos órganos o tejidos.
Si el promotor que se emplea para controlar la expresión de Cre se activa en un momento concreto del ciclo vital del animal, tendremos un knockout controlado temporalmente. De forma similar, si el promotor es sensible a la presencia de fármacos tendremos un knockout inducible, de forma que podremos disparar la destrucción del gen en el momento en que inyectemos la sustancia adecuada. Por supuesto, cualquier combinación de todo lo anterior es posible y la imaginación del investigador es el único límite para este tipo de tecnología.
MODELOS DE RATÓN CRE INDUCIBLES
En el caso de los modelos inducibles lo que tenemos es un tipo de recombinasaCre que permanece inactiva hasta que introducimos un ligando o sustrato que le permita activarse. Estos tipos de sistemas Cre son útiles en situaciones en las que queremos controlar el momento de la actividad Cre, durante una etapa específica de desarrollo o edad.
El tipo más común de Cre inducible es un sistema inducible por tamoxifeno que permite que Cre se transloque al núcleo donde se activa y puede llevar a cabo el evento de eliminación y recombinación.
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MODELOS DE RATÓN CRE REPORTEROS
Una cepa reportera es una cepa en la que una proteína reportera, que suele ser algo que se puede detectar visualmente, como GFP o RFP, incluso lacZ, se expresa sólo cuando está en presencia de Cre.
La forma que se ha ideado para hacer esto es integrar un casete de parada transcripcional antes de la secuencia que codifica para el reportero (en este caso lacZ) y se flanquea el casete de parada con dos sitios loxP. Por lo tanto, en presencia de Cre, el casete de parada se elimina y el gen reportero puede ser expresado.
Este tipo de casetes LSL, o casetes lox-stop-lox con estos reporteros permiten a los investigadores evaluar la actividad de Cre usando la proteína fluorescente o lacZ como sustituto.
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Un ejemplo de una cepa reportera Cre conlacZ-reporter se cruzó con una cepa Cre generalizada y la expresión de lacZ se detecta mediante tinción con Bgal.
El embrión control no tiene tinción, pero la cepa reportera cruzada muestra actividad generalizada.
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Se puede utilizar esto para probar y evaluar cualquier cepa Cre específica.
Si se quiere ver la expresión de Cre en el sistema nervioso y tenemos una línea de NestinCre, se cruza con un reportero lacZ y se evalúa la actividad del reportero en las células de interés, además se comprueba si se expresa en otros lugares.
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En este caso la actividad Cre es activa en el cerebro, la médula espinal y otras partes del sistema nervioso central y periférico de estos embriones E15.5, lo que confirma la especificidad que se está buscando.
El sistema Cre/lox es una de las herramientas más potentes y versátiles desarrolladas para la genética de ratones. Proporciona a los investigadores que utilizan ratones un control sofisticado sobre la ubicación y el momento de la expresión genética. Cre/lox se utiliza normalmente para producir alelos knockout, pero también se puede utilizar para activar la expresión genética.
AUTORA
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