Una de las funciones celulares más importante es la proliferación celular, ya que es esencial tanto para la supervivencia de las células, como para la regeneración tisular y la reparación. Por tanto, evaluar la respuesta proliferativa a distintos estímulos y/o tratamientos puede ser fundamental para nuestras investigaciones.
La ventaja que supone el uso de la citometría de flujo radica en la rapidez de obtención de resultados, la capacidad de cuantificación y la posibilidad de medir varias propiedades y/o parámetros de forma simultánea.
Incorporación de análogos de nucleótidos durante la síntesis de ADN:
Durante la proliferación ocurre nueva síntesis de ADN, con lo que si añadimos análogos de nucleótidos como la BrdU o la EdU (5-ethynyl-2´deoxyuridine) al medio de cultivo, todas aquellas células que entren en proliferación incorporarán estos análogos a su ADN. Una vez transcurrido el tiempo de análisis, estos análogos se pueden detectar con anticuerpos específicos (en el caso de BrdU) o mediante una reacción “Click-IT” (EdU-Click-IT), que tiene como ventaja que no hace falta desnaturalizar el ADN para detectar la incorporación de EdU. Esto último implica que se pueden analizar otros parámetros de forma simultánea, ya sea por tinción con anticuerpos o analizando la presencia de proteínas fluorescentes (A). Además, se pueden analizar la fracción de células que se encuentran en las distintas fases del ciclo celular (B).
Método de la dilución de reactivo fluorescente:
Este método está basado en la utilización de reactivos que son fluorescentes cuando se unen a grupos amino en el interior celular. Cuando las células se dividen, la fluorescencia se distribuye a partes iguales entre las células hijas, con lo que se puede medir proliferación analizando la disminución de fluorescencia.
Algunos de estos reactivos son el carboxy fluorescein diacetate succinimidyl ester o CFSE, o los tintes tipo CellTrace, como el Tag-It-Violet.
La ventaja de estos reactivos es que se pueden utilizar junto con tinciones con anticuerpos contra proteínas de superficie o intracelulares, con el fin de analizar cómo proliferan diferentes poblaciones en un cultivo heterogéneo y en respuesta a un mismo tratamiento.
Uso de modelos:
Algunos programas de análisis permiten la utilización de plataformas para el ajuste a modelos matemáticos de los datos obtenidos. Estas plataformas nos permiten obtener datos como el nº de divisiones promedio que ha tenido cada célula o el porcentaje de precursores iniciales que han proliferado, entre otros.
Tips finales:
•Determina cuáles son los mejores tiempos de cultivo para analizar tu experimento.
•Optimiza la concentración de reactivo, ya que puede ser tóxico en exceso.
•Analiza tus datos con ajuste a modelos.
AUTOR
Virginia Vila del Sol, PhD
Responsable del Servicio de Citometría de Flujo.
Hospital Nacional de Parapléjicos.
Toledo, España.
Referencias
Roederer M (2011) https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cyto.a.21010
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