En esta newsletter profundizaremos sobre la cuantificación proteica diferencial sin marcaje, la estrategia denominada Label-Free Quantitation (LFQ).
La cuantificación de proteínas label-free es un método para identificar y cuantificar cambios relativos en dos o más muestras biológicas.
Flujo de trabajo
Hay varios pasos fundamentales involucrados en la proteómica cuantitativa label-free, incluida la preparación de muestras (extracción, reducción, alquilación y digestión de proteínas), separación de muestras por cromatografía líquida junto con el análisis por espectrometría de masas en tándem y análisis de datos (identificación de péptidos / proteínas, cuantificación y análisis estadístico). En este caso cada muestra se prepara por separado y luego se somete al análisis individual por LC-MS/MS.
Según el método utilizado para la extracción de datos, en general se pueden dividir en dos grupos distintos, por un lado, la cuantificación se puede inferir contando el número de péptidos o espectros asignados a una proteína determinada y, por lo tanto, se denominan genéricamente métodos de recuento espectral. Por otro lado, cuando la cromatografía líquida se combina con la espectrometría de masas, los valores cuantitativos se pueden medir mediante la extracción del área de los picos cromatográficos de los iones precursores, el área bajo la curva (AUC) o los métodos de intensidad de la señal MS1. (Figura 1)
Figura 1. Enfoques generales de proteómica cuantitativa. (a) Método shotgun de marcaje isotópico. Después del marcaje con isótopos estables (light / heavy), el control y la muestra se combinan y analizan mediante LC-MS / MS. La cuantificación se calcula en base a la relación de intensidad de pares de péptidos marcados con isótopos. (b) Proteómica cuantitativa sin marcaje. El control y la muestra están sujetos a análisis individuales de LC-MS / MS. La cuantificación se basa en la comparación de la intensidad máxima del mismo péptido o el recuento espectral de la misma proteína.
En cuanto a la estrategia de recuento espectral, la cuantificación relativa de proteínas se logra comparando el número de espectros MS/MS identificados de la misma proteína, donde se ha demostrado que se correlaciona directamente con la abundancia de proteínas. Algunos investigadores piensan que es posible porque un aumento en la abundancia de proteínas generalmente resulta en un aumento en el número de sus péptidos proteolíticos. Las cantidades crecientes de digestiones generalmente conducen a un aumento en la cobertura de la secuencia de proteínas, el número de péptidos únicos identificados y el número de espectros MS/MS totales identificados (recuento espectral) para cada proteína. Debido a la facilidad de implementación, no se han desarrollado herramientas o algoritmos específicos especialmente para métodos de conteo espectral. Pero la normalización y el análisis estadístico del conjunto de datos de conteo espectral es necesario para la detección precisa y confiable de cambios de proteínas en mezclas complejas.
Mientras que en la cuantificación mediante la intensidad de iones se ha observado que la intensidad de la señal de ionización por electrospray (ESI) se correlaciona con la concentración de iones. La altura o el área del pico en una relación masa-carga particular (m/z) de un espectro de masas refleja el número de iones para ese m/z detectado por el espectrómetro de masas en un momento dado, lo que generalmente se conoce como la abundancia de iones. Aunque la abundancia de iones no puede usarse para inferir directamente la concentración absoluta de proteína o péptido (debido a la diferente eficiencia de ionización para cada péptido), la comparación de la proporción de abundancias de iones entre péptidos idénticos obtenidos en diferentes ejecuciones de experimentos se puede usar para estimar la expresión diferencial.
Cuenta con ciertas ventajas frente a las estrategias con marcaje que hacen que sea uno de los métodos de cuantificación más en auge:
- Se elimina la variabilidad que puede introducir el marcaje o etiquetado químico.
- Se puede implementar en cualquier tipo de espectrómetro de masas, se usa ampliamente con buenos resultados debido a las mejoras en la reproducibilidad de los instrumentos y los esquemas avanzados de adquisición y procesamiento de datos.
- Las etiquetas químicas y metabólicas suelen ser caras con lo que el LFQ tiene un menor coste.
- El tiempo de preparación de la muestra se reduce significativamente mediante la eliminación de numerosos pasos.
- No hay límite en el número de muestras y, en principio, es aplicable a cualquier tipo, incluidos los materiales que no pueden marcarse metabólicamente directamente (por ejemplo, muchas muestras clínicas) siendo ideal para análisis de muestreo grande en experimentos de detección clínica o de descubrimiento de biomarcadores.
También hay que tener en cuenta las limitaciones que este tipo de cuantificación conlleva:
- La cuantificación Label-free tiene limitaciones inherentes en el rendimiento, ya que solo analiza una muestra por ejecución de LC‐MS, y en precisión, ya que no corrige la variabilidad analítica.
- La cuantificación relativa se logra, como hemos visto, comparando el área del pico de iones precursores al nivel de MS1 o contando el número de espectros de MS2 por péptido, por lo tanto, es propenso a verse afectado por cambios en el tiempo de retención, cambios en la eficiencia de la ionización y variaciones en la pérdida de muestra durante el procesamiento de una inyección a otra, por lo que podría ser necesario un mayor número de réplicas técnicas.
CONCLUSIÓN
El rápido desarrollo de la proteómica cuantitativa label-free ha proporcionado una medición rápida y de bajo costo de los niveles de expresión de proteínas en muestras biológicas complejas.
La comparativa basada en la intensidad de pico y en recuento espectral son los dos métodos más utilizados de cuantificación sin marcaje. Comparado con los métodos de etiquetado isotópico, los experimentos label-free deben ser controlados más cuidadosamente debido a un posible error causado por variaciones entre carreras de LC y MS. Sin embargo, el desarrollo de separaciones altamente reproducibles por nano-HPLC, espectrómetros de masas de alta resolución y delicadas herramientas computacionales ha mejorado enormemente la fiabilidad y precisión de este tipo de abordaje. Software de procesamiento de datos comercialmente disponibles son capaces de detectar, emparejar y analizar péptidos de cientos de experimentos LC-MS diferentes simultáneamente, lo que proporciona una técnica de alto rendimiento para el descubrimiento de biomarcadores relacionados con enfermedades. La metodología label-free basada en conteo espectral se correlaciona positivamente con la cuantificación con marcaje isotópico y permite la cuantificación relativa y absoluta de proteínas. Estos enfoques cuantitativos label-free son una herramienta rigurosa y poderosa para analizar cambios proteicos en estudios proteómicos a gran escala.
AUTOR
Alba González Arandilla, MSc.
Especialista en espectrometría de masas.
Hospital Nacional de Parapléjicos.
Toledo, España.
Referencias
- Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Anal Bioanal Chem (2007) 389: 1017–1031. DOI 10.1007/s00216-007-1486-6.
- Proteome Analyses of Hepatocellular Carcinoma Article in Journal of Clinical and Translational Hepatology. March 2014. DOI: 10.14218/JCTH.2013.00022
- Chemical isotope labeling for quantitative proteomics. Xiaobo Tian 1, Hjalmar P Permentier 1, Rainer Bischoff 1. PMID: 34091937. DOI: 10.1002/mas.21709.
- Mass Spectrometry-Based Label-Free Quantitative Proteomics. Wenhong Zhu,1 JeffreyW. Smith,1 and Chun-Ming Huang2.
- https://www.creative-proteomics.com/blog/index.php/label-free-quantitative-proteomics
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