La microscopía óptica es una de las herramientas más importantes de las ciencias en general y en la biología en particular ya que permite observar en un tamaño aumentado elementos que son imperceptibles a simple vista. A través de los años se han desarrollado numerosas técnicas para mejorar tanto el contraste como la calidad de las imágenes obtenidas mediante microscopia. Sin embargo, estas técnicas se encontraban limitadas por la resolución con la que se podían observar las muestras. Ésta Newsletter es la primera de una serie de tres, en las que explicaremos las técnicas de súper-resolución que en los últimos años han roto las barreras impuestas por la física de la luz. Mediante estas técnicas se ha conseguido observar por debajo de los límites de resolución, incluso en muestras vivas.
1. LIMITES DE RESOLUCIÓN ÓPTICA
Cuando la luz entra en un microscopio es refractada por las lentes utilizadas tanto para iluminar como para aumentar y formar la imagen. Pero debido a la naturaleza ondulatoria de la luz y a los efectos de difracción que imponen las lentes se produce un patrón característico de interferencia en la luz observada. Estas interferencias consisten en una serie de regiones iluminadas y oscuras. Este patrón de interferencias producidas por la difracción forma una región central brillante conocida como disco de Airy rodeada de una serie de anillos concéntricos denominados anillos de Airy. De esta manera una molécula fluorescente no se ve como un punto discreto de luz en el plano focal, sino como un pequeño disco de Airy, que además es cientos de veces mayor al tamaño de molécula individual que emite la luz rodeado por anillos concéntricos (anillos de Airy). Pues bien, cuando dos o más moléculas se encuentran juntas, estos discos de luz se sobreponen, dando una imagen cuya resolución es del orden de la longitud de onda de la luz utilizada. Es decir, estos anillos de difracción limitan la capacidad del microscopio óptico de resolver los detalles finos de la muestra. (Ver figura 1).
La potencia de resolución de un microscopio óptico depende de la capacidad del microscopio de distinguir entre dos detalles estructurales adyacentes, sin la interferencia de discos de Airy. Por lo tanto, la potencia de resolución de un microscopio óptico depende de la longitud de onda de la luz utilizada (λ) y de la apertura numérica (NA) de la lente de objetivo. (Ver figura 2).
La distancia mínima para que dos componentes de un sistema puedan diferenciarse con un microscopio es límite de difracción de Abbe. Este límite de difracción es de aproximadamente 200 nm, y fue determinado ya en el año 1873 por Ernst Karl Abbe. Para superar estos límites de resolución es necesario utilizar microscopios electrónicos, donde las muestras deben ser procesadas de tal manera que es completamente imposible observar en muestras vivas.
2. SÚPER-RESOLUCIÓN: Rompiendo los límites de resolución
En el año 2014 se otorgó el Premio Nobel de Química a Eric Betzig, Stefan W. Hell y William E. Moerner por el desarrollo de técnicas novedosas de microscopía óptica de fluorescencia que permiten obtener imágenes de sistemas vivos con una resolución espacial de nanómetros, rompiéndose así, la barrera del límite de difracción de Abbe que la física óptica había impuesto durante toda la historia de la microscopía.
Aunque recibieron el premio en conjunto, los tres investigadores desarrollaron diferentes métodos para lograr resolver las imágenes por debajo del límite de difracción. Por un lado, Stefan Hell desarrolló la técnica de agotamiento de emisión estimulada (STED, por sus siglas en inglés: Stimulated Emission Depletion Microscopy) y, por otro lado William Moerner y Eric Betzig desarrollaron otras técnicas basadas en la localización de moléculas individuales, PALM (Photo-activated localization microscopy o microscopía de localización foto-activada) y STORM (Stochastic optical reconstruction microscopy o microscopía óptica estocástica de reconstrucción).
En próxima Newsletter de microscopía desarrollaremos estas dos técnicas de súper-resolución.
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